一种用于细菌总RNA提取的裂解方法、试剂盒和提取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于细菌总RNA提取的裂解方法、试剂盒和提取方法，试剂盒包括裂解液，绑定液，漂洗液以及洗脱液，其中，裂解液包括终浓度为10

【技术实现步骤摘要】
一种用于细菌总RNA提取的裂解方法、试剂盒和提取方法


[0001]本专利技术属于细菌RNA提取
，具体涉及一种用于细菌总RNA提取的裂解方法、试剂盒和提取方法。

技术介绍

[0002]在人类的体内和体表，微生物的数量是人类细胞的1
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10倍，这些微生物细胞构成了人类的微生物组，人类微生物组的类型包括真菌、古菌、细菌和病毒。美国国立卫生研究院于2008年开展了人类微生物组计划，旨在全面揭示人类微生物组的特征，分析其在人类健康和疾病中发挥的作用，同时该计划还研究了与疾病状态相关的多类微生物体，指出了体内微生物群紊乱对疾病发展的影响。传统上，对于影响人类健康的微生物体的研究着力于对病人体内病原体的鉴定和随后的抗生素治疗，然而随着抗生素耐受问题日益严重，以及全球人口密度和流动性日趋增加增强，这一诊疗模式亟待进一步的革新。随着高通量测序技术(或称第二代测序技术)的飞速发展和应用，研究者因之获得一种更为综合的检测方案，能够更好地了解与人类健康相关的微生物体，尤其是细菌的全面面貌。
[0003]细菌的转录组测序能够获知其基因表达和生命代谢通路的信息，了解细菌参与到哪些生命活动中，将这些细菌的转录组测序序列和基因组序列进行比较，研究者能够对细菌的基因、调控元件和操纵子结构进行定位和定性。将细菌转录组测序与其他检测技术结合，研究者能够获知疾病发生与传播过程中相关病原的进展和特殊代谢通路的具体细节。然而，与真核细胞不同，细菌的转录组测序相对更具挑战性，一方面是因为细菌的mRNA没有polyA尾巴结构，无法对其进行高效富集，另一方面是细菌细胞的RNA含量远低于哺乳动物细胞(约100倍差异)，使得对于非实验室培养和非模式细菌的mRNA测序更为复杂。而从细菌中分离高质量的总RNA尤为困难，如与人类疾病相关的一类重要病原体——分枝杆菌属细菌，其具备复杂的细胞壁结构，含有共价结合的肽聚糖、半乳聚糖和霉菌酸，富含其他多糖物质(葡聚糖、甘露聚糖等)、长链多甲基化分支腊质和磷脂，这些物质使得细菌难以被常规的变性剂和去垢剂裂解，因而难以获得足量的高纯度的总RNA。目前，市面上针对细菌总RNA提取试剂盒较少，传统上对细菌的提取方法主要基于酶法裂解、超声破碎、气压破碎和机械破碎，但操作相对繁琐，样本处理通量较低，对人员素质要求较高，RNA的纯度和得率均不理想。
[0004]因此，开发一种操作简单，提取质量高的细菌总RNA的提取试剂盒是很有必要的。

技术实现思路

[0005]针对目前所存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于细菌总RNA提取的裂解方法、试剂盒和提取方法，通过裂解液和热裂解结合的方法较快较好地破除细菌的细胞壁，使RNA充分地从复杂的次级代谢物中释放出来，后续基于磁珠纯化的方式，可以适配多类磁棒法全自动核酸提取设备，能够实现更高的样本处理通量。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：
[0007]本专利技术的第一方面提供了一种用于细菌总RNA提取的裂解方法，包括如下步骤：
[0008](1)裂解液准备：裂解液包括终浓度为10
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20m mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，终浓度为25
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100m mol/L的乙二胺四乙酸，终浓度为0.5
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2％的十二烷基硫酸钠，终浓度为30
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80％的水饱和酚；
[0009](2)热裂解：细菌样本置于样本管a中，加入裂解液，涡旋振荡分散至菌体细胞无结块，样本管置于60
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70℃金属浴，1300rpm
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1500rpm振荡30
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60min。
[0010]本专利技术的第二方面提供了一种细菌总RNA提取试剂盒，包括前文所述的裂解液，绑定液，漂洗液以及洗脱液，所述绑定液包括终浓度100
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500m mol/L的醋酸钠和终浓度50
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85％的乙醇，所述漂洗液为终浓度75％的乙醇，所述洗脱液为无核酸酶水。
[0011]本专利技术的第三方面提供了利用试剂盒进行细菌总RNA提取的方法，包括如下步骤：
[0012]S1，取细菌样本置于样本管a中，加入裂解液，涡旋振荡分散至菌体细胞无结块，样本管置于60
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70℃金属浴，1300rpm
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1500rpm振荡30
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60min；
[0013]S2，将完成S1的样本管a置于冰上孵育4
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6min，在4℃，10000
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13000g，高速离心4
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6min，离心后移取上清液到样本管b中；
[0014]S3，向样本管b中加入350
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450μL水饱和酚和150
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250μL氯仿，常温金属浴1300rpm
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1500rpm振荡4
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6min；
[0015]S4，样本管b在4℃，10000
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13000g，高速离心8
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12min；离心后移取上清液到样本管c中；
[0016]S5，向样本管c中加入350
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450μL绑定液和8
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12μL的磁珠，置于混匀仪上，室温振荡混匀，随后将样本管c放置在磁力架上，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；
[0017]S6，向完成S5的容器c中加入550
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650μL漂洗液，将容器c从磁力架上转移到混匀仪上，振荡混匀30
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90s，在磁力架上静置，磁珠完全吸附后，弃上清；
[0018]S7，向完成S6的容器c中加入550
‑
650μL漂洗液，将容器c从磁力架上转移到混匀仪上，振荡混匀30
‑
90s，在磁力架上静置，磁珠完全吸附后，弃上清，室温下晾干；
[0019]S8，向晾干的容器c中加入40
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60μL洗脱液，放置在磁力架上静置2
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4min，然后转移到混匀仪上，振荡混匀3
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7min；
[0020]S9，将完成S8的容器c置于磁力架上静置2
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5min，磁珠完全吸附后，将上清溶液转至容器d中，容器d中的上清液即为提取得到的RNA产物，
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80℃保存。
[0021]本专利技术的有益效果
[0022]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的细菌总RNA提取试剂盒及裂解和提取方法，采用裂解液和热裂解相结合的方法，能够较快较好地破除细菌的细胞壁，使RNA充分地从复杂的次级代谢物中释放出来，并与含量丰富的次级代谢物分离，离心去除难溶的杂质，使用酚氯仿抽提使样本中的蛋白质等大分子变性，并形成有机相和水相，变性的蛋白质存在于有机相和中间层中，RNA存在于上层水相中，吸取上清液使用醇类绑定液聚沉其中的RNA，并与硅基磁珠结合，随后进入全自动化RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于细菌总RNA提取的裂解方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)裂解液准备：裂解液包括终浓度为10
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20m mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，终浓度为25
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100m mol/L的乙二胺四乙酸，终浓度为0.5
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2％的十二烷基硫酸钠，终浓度为30
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80％的水饱和酚；(2)热裂解：细菌样本置于样本管a中，加入裂解液，涡旋振荡分散至菌体细胞无结块，样本管置于60
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70℃金属浴，1300rpm
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1500rpm振荡30
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60min。2.一种细菌总RNA提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的裂解液，绑定液，漂洗液以及洗脱液，所述绑定液包括终浓度100
‑
500m mol/L的醋酸钠和终浓度50
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85％的乙醇，所述漂洗液为终浓度75％的乙醇，所述洗脱液为无核酸酶水。3.利用权利要求2所述的试剂盒进行细菌总RNA提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，取细菌样本置于样本管a中，加入裂解液，涡旋振荡分散至菌体细胞无结块，样本管置于60
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70℃金属浴，1300rpm
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1500rpm振荡30
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60min；S2，将完成S1的样本管a置于冰上孵育4
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6min，在4℃，10000
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13000g，高速离心4
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6min，离心后移取上清液到样本管b中...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷楠楠，邓阳红，蔡霖霖，段亚廷，
申请(专利权)人：杭州联川基因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：