一种检测制造技术

本发明专利技术公开了一种检测

【技术实现步骤摘要】
一种检测EGFR T790M突变的引物探针组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于基因突变检测领域，具体地，涉及一种检测
EGFR T790M
突变的引物探针组
、
试剂盒及方法
。

技术介绍

[0002]EGFR
主要位于细胞膜上，其基因编码受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族成员之一
。EGFR
被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白
、
酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移
、
黏附
、
增值
、
分化和凋亡
。
研究表明，在许多实体肿瘤中存在
EGFR
信号转导通路上的基因发生体细胞突变及表达异常，从而导致肿瘤细胞无限制的扩增和迁移
。
[0003]EGFR
基因突变主要发生在
18
号
‑
21
号外显子激酶结构域，
EGFR
基因
20
外显子第
790
位氨基酸由甲硫氨酸代替苏氨酸的这种变化简称为
T790M
突变，约占继发性耐药的
60
％
。T790M
是第一个报道的继发性耐药基因，它通过改变
ATP
结合口袋的晶体结构，在结构上抑制第一代
EGFR
‑
TKIs
与
ATP
>结合位点的结合，因此，发生
T790M
突变后
TKIs
药物不能抑制下游信号的转导，癌细胞不受控制
。
[0004]肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，在我国，肺癌的发病率及死亡率亦居各种恶性肿瘤的首位
。
非小细胞肺癌
(NSCLC)
作为肺癌的主要类型，占肺癌患者的
85
％以上，并且多数患者确诊时已处于晚期，丧失了手术治疗的机会，需要进行化疗或分子靶向治疗
。
[0005]表皮生长因子受体
(epidermal growth factor receptor
，
EGFR)
驱动基因及其酪氨酸激酶抑制剂
(tyrosine kinase inhibitors
，
TKI)
的发现为
EGFR
基因突变的肺腺癌患者带来了曙光
,
可以带来约
10
个月的无进展生存期
(Progression free survival
，
PFS)
，然而，随着肺癌基因分型及分子靶向药物的发展，以吉非替尼
、
厄洛替尼为代表的靶向治疗已成为晚期非小细胞肺癌内科治疗的主要手段，并取得了惊人效果，但是，即使
EGFR
‑
TKI
初始治疗非常有效的患者，治疗一段时间之后，最终还是会出现继发性耐药而导致疾病的进展
。
相当一部分患者在接受
EGFR
‑
TKIs
治疗前也会存在
EGFR
‑
T790M
突变，即原发性
EGFR
‑
T790M
突变
。EGFR
‑
T790M
突变已经被证实是1代
EGFR
‑
TKIs
最主要的耐药机制
。
[0006]针对
NSCLS
患者靶向用药及伴随诊断中，相应的检测技术能够尽可能早地精准诊断和治疗，以提高患者的生存率和治疗效果
。
然而现有的检测技术，通常采用组织样本进行检测，对于难以获得肿瘤组织样本的患者，可以采用外周血
cfDNA
作为补充替代标本评估
EGFR
基因突变状态
。
然而，血浆
、
积液等临床样本中，样本量极少，尤其是血液样本中
cfDNA
提取浓度较低，
4mL
全血提取的
cfDNA
浓度主要集中在
0.8ng/
μ
L
～
5ng/
μ
L
之间，低样本量的情况下，一般比较难达到很高的灵敏度，漏检，错检的发生概率很高
。
为满足低样本量下的检测需求，针对
EGFR T790M
突变检测中低上样量高灵敏度的问题亟待解决
。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题中的至少一个问题，本专利技术提供了一种检测
EGFR T790M
突变的引物探针组
、
试剂盒及方法，采用本专利技术的技术方案，不仅可以检测肿瘤组织
DNA EGFR T790M
基因突变，同时还可以检测人类外周血
cfDNA EGFR T790M
基因突变，并且特异性强
、
灵敏度高；配合采用数字
PCR
简便快捷
、
操作简单安全
、
自动化程度高
。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面提供了一种检测
EGFR T790M
突变的引物探针组，所述引物探针组包括如下引物和探针序列：
[0010]用于扩增
EGFR T790M
突变的上游引物，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
[0011]用于扩增
EGFR T790M
突变的下游引物，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；
[0012]用于检测
EGFR T790M
突变型位点的探针，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；
[0013]用于检测
EGFR T790M
野生型位点的探针，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；其中，探针的核苷酸序列中“+”后面的
A
，
T
，
C
，
G
表示用锁核酸
LNA
代替普通碱基
。
[0014]在一些具体实施方案中，所述用于检测
EGFR T790M
突变型位点的探针和用于检测
EGFR T790M
野生型位点的探针均带有荧光集团和淬灭集团，突变型位点的探针和野生型位点的探针的荧光集团不同
。
在一些具体实施方案中，用于检测
EGFR T790M
突变型位点的探针，5’
端荧光集团选择
FAM
集团，淬灭基团连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测
EGFR T790M
突变的引物探针组，其特征在于：所述引物探针组包括如下引物和探针序列：用于扩增
EGFR T790M
突变的上游引物，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；用于扩增
EGFR T790M
突变的下游引物，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；用于检测
EGFR T790M
突变型位点的探针，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；用于检测
EGFR T790M
野生型位点的探针，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；其中，探针的核苷酸序列中“+”后面的
A
，
T
，
C
，
G
表示用锁核酸
LNA
代替普通碱基
。2.
根据权利要求1所述的一种检测
EGFR T790M
突变的引物探针组，其特征在于：所述用于检测
EGFR T790M
突变型位点的探针和用于检测
EGFR T790M
野生型位点的探针均带有荧光集团和淬灭集团，突变型位点的探针和野生型位点的探针的荧光集团不同
。3.
权利要求1或2所述的一种检测
EGFR T790M
突变的引物探针组在制备数字
PCR
定量检测肿瘤组织
DNA
和
/
或人类外周血
cfDNA EGFR T790M
突变的检测试剂中的应用
。4.
一种定量检测
EGFR T790M
突变的检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的引物探针组
。5.
根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括核酸提取试剂
、DNA
聚合酶混合液
。6.
非疾病诊断目的的检测
EGFR T790M
突变的数字
PCR
检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、
提取样本
DNA
模板；
S2、
以
S1
提取的样本
DNA
为模版，使用权利要求1‑2任一项所述引物探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：田玉琦，李璐璐，郎秋蕾，
申请(专利权)人：杭州联川基因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：