一种扩增靶核酸的试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种扩增靶核酸的试剂盒和方法，该试剂盒包括第一特异性引物，第一通用引物，第二通用引物，侧翼靶片段，聚合酶和核苷酸；该方法包括：提供第一特异性引物，第一通用引物，第二通用引物，侧翼靶片段，聚合酶和核苷酸；进行靶筛选，包括一轮第一热循环过程，该过程包括变性步骤

【技术实现步骤摘要】
一种扩增靶核酸的试剂盒和方法
[0001]相关申请
[0002]本申请是申请号为
202010012269.7、
申请日为
2014
年
11
月
26
日
、
专利技术名称为“一种扩增靶核酸的方法”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请的申请号为
201480073756.7、
申请日为
2014
年
11
月
26
日
、
专利技术名称为“选择性扩增核酸序列”的国际申请号为
PCT/US2014/067666
的中国国家阶段申请
。
[0003]此前申请
[0004]此申请要求
2013
年
11
月
26
日提交的美国序列号
61/693,211
的优先权，现将其全部纳入此申请中
。
专利

[0005]本专利技术涉及核酸序列复制领域，包括聚合酶链反应
(PCR)。
具体而言，本专利技术涉及用于从一个或多个模板序列中扩增一个或多个靶序列的方法和组合物
。
特别地，本专利技术提供了新的引物设计来增强
PCR
反应的特异性
。
本专利技术还提供了方法和组合物，使得在单个反应管中能够使用特异性引物进行特定序列区段的选择并使用一对通用引物扩增所有选择的序列区段
。
[0006]背景
[0007]许多生物和生物医学领域的应用，如遗传疾病筛查
、
个体医学
、
法医检验和靶向测序，需要从大量的核酸序列
(
如各种活细胞基因组
DNA
，宏基因组样品核酸序列的混合物，肠道菌群的微生物组
DNA)
中复制和
(
或
)
扩增一个或多个选定的核酸序列区段
。PCR
是一种从核酸混合物中选择性扩增目的核酸序列的强大工具
。
涉及多个目的序列的多重
PCR
应用已得到广泛应用
。1988
年，
Chamberlain
等人在“Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNAamplification”这篇文章中首次报道了多重
PCR
法，文章发表在
《Nucleic Acids Research》
上
(Nucleic Acids Res.1988,16:11141
‑
11156)。
但是，
Henegariu
等人在
1997
年发表在
《Bio Techniques》
上的“Multiplex PCR:Critical Parameters and Step
‑
by
‑
Step Protocol”中描述道：由于繁重的优化工作要求，通常认为传统的多重
PCR
很难在每个反应中进行几十个以上的靶
(BioTechniques.1997,23:504
‑
511)。
正如
Edwards
等人在
1994
年发表在
《Genome Research》
上的“Multiplex PCR:advantages,development,and applications”中所述，多重
PCR
的主要挑战包括引物二聚体的形成
、
靶扩增的不均一性和错配率高
(Genome Res.1994,3:S65
‑
75)。
[0008]为了统一引物依赖性的
PCR
条件，
A.P.Shuber
等人于
1995
年发表在
《Genome Research》
上的“ASimplified Procedure for Developing Multiplex PCRs”中描述了多重
PCR
的一个变体
(Genome Res.1995,5:488
‑
493)。
在多重
PCR
中使用了嵌合引物，每个嵌合引物都包含一个与序列特异性识别位点互补的
3'
区和由非相关的
20
个核苷酸序列组成的
5'
区
。
证明了包含嵌合基序的
PCR
引物对都使用了相同的反应条件
、
循环次数和退火温度
。
这种方法被认为有助于消除研发的多重
PCR
中所涉及的多个优化步骤
。
然而，单个引物浓度
的调整仍然是必需的
。
本专利技术提供了一种消除单个引物浓度调整要求的解决方案
。
[0009]为降低引物二聚体的形成和减少错配事件的发生，多重
PCR
的变体已有报道
。Z.Lin
等人于
1996
年发表在
《Proceedings of the National Academy of Sciences》
上的“Multiplex genotype determination at a large number of gene loci”中描述了一种转换多重扩增为单重扩增的方法，以减少引物与引物之间的相互作用
(Natl.Acad.Sci.1996
，
93:2582
‑
2587)。
实施方法的过程包括三轮独立的
PCR。
在前两轮
PCR
中，位点特异引物，含有
5'
端通用尾部序列
(tail)
或标记序列
(tag)
，用于将通用尾部序列添加进靶序列
。
然后，在第3轮中，所有通用的尾部标记的靶
(26
个基因位点
)
可被与通用尾部序列匹配的一对通用引物同时地扩增
。
第一轮和第二轮类似于传统的多重
PCR
，需要一个耗时的涉及引物浓度调整的优化过程
。
此外，工作流程含有多个人工操作步骤，包括三轮独立的
PCR
和
PCR
轮之间
PCR
产物的纯化
。
作为比较，本专利技术提供了一种显著简化的工作流程
。
[0010]1991
年，
A.J.Jeffreys
等人发表在
《Natu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种扩增靶核酸的试剂盒，该试剂盒包括第一特异性引物，第一通用引物，第二通用引物，侧翼靶片段，聚合酶和核苷酸，其中，所述第一特异性引物为
Ω
引物，所述
Ω
引物包括
3p
臂
、
环和
5p
臂，
3p
臂和
5p
臂用于与靶核酸杂交并且
5p
臂比
3p
臂具有更高的结合能
。2.
一种扩增靶核酸的试剂盒，该试剂盒包括第一特异性引物，第二特异性引物，第一通用引物，第二通用引物，靶核酸，聚合酶和核苷酸，其中，所述第一特异性引物和所述第二特异性引物均为
Ω
引物，所述
Ω
引物包括
3p
臂
、
环和
5p
臂，
3p
臂和
5p
臂用于与靶核酸杂交并且
5p
臂比
3p
臂具有更高的结合能
。3.
如权利要求1或2所述的方法，任选地，第一特异性引物具有
3'
端和
5'
端，其中
3'
端包含第一序列特异性区段，并且
5'
端包含第一通用区段；任选地，第二特异性引物具有
3'
端和
5'
端，其中
3'
端包含第二序列特异性区段，并且
5'
端包含第二通用区段；任选地，通用引物有尾区段和通用区段
。4.
一种扩增靶核酸的方法，该方法包括：提供第一特异性引物，第一通用引物，第二通用引物，侧翼靶片段，聚合酶和核苷酸；进行靶筛选，包括一轮第一热循环过程，该过程包括变性步骤
、
退火步骤和延伸步骤；以及进行扩增，包括两轮或多轮第二热循环过程，该过程包括变性步骤
、
退火步骤和延伸步骤，从而扩增靶核酸，其中，所述第一特异性引物为
Ω
引物，所述
Ω
引物包括
3p
臂
、
环和
5p
臂，
3p
臂和
5p
臂用于与靶核酸杂交并且
5p
臂比
3p
臂具有更高的结合能
。5.
一种扩增靶核酸的方法，该方法包括：提供第一特异性引物，第二特异性引物，第一通用引物，第二通用引物，靶核酸，聚合酶和核苷酸；进行靶筛选，包括两轮第一热循环过程，该过程包括变性步骤
、
退火步骤和延伸步骤；以及进行扩增，包括两轮或多轮第二热循环过程，该过程包括变性步骤
、
退火步骤和延伸步骤，从而扩增标核酸，其中，所述第一特异性引物和所述第二特异性引物均为
Ω
引物，所述
Ω
引物包括
3p
臂
、
环和
5p
臂，
3p
臂和
5p
臂用于与靶核酸杂交并且
5p
臂比
3p
臂具有更高的结合能
。6.
如权利要求4或5所述的方法，任选地，第一特异性引物具有
3'
端和
5'
端，其中
3'
端包含第一序列特异性区段，并且
5'
端包含第一通用区段；任选地，第二特异性引物具有
3'
端和
5'
端，其中
3'
端包含第二序列特异性区段，并且
5'
端包含第二通用区段；任选地，通用引物有尾区段和通用区段

【专利技术属性】
技术研发人员：周小川，朱奇，张小林，盛苨晶，
申请(专利权)人：杭州联川基因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：