一种CHO残留DNA检测试剂盒及其使用方法技术

本申请提供了一种CHO残留DNA检测试剂盒，所述CHO残留DNA检测试剂盒包括以下部分：(1)qPCR扩增反应液，(2)CHO探针和扩增引物的混合液，(3)DNA稀释液，(4)标准定量参考液；通过选用特定序列的扩增引物和CHO探针，增强DNA检测的特异性，进一步优化扩增反应体系，提高扩增效率、检测灵敏度并扩宽线性检测范围；本申请的试剂盒检测方法快速准确、数据可靠性高、操作简便，可用于检测疫苗成品、半成品、抗体样品中的CHO细胞残留的DNA。中的CHO细胞残留的DNA。

【技术实现步骤摘要】
一种CHO残留DNA检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，C12Q1/68，尤其涉及一种CHO残留DNA检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]在重组生物蛋白制品(如抗体、疫苗等)中存在的残余DNA大多数来源于培养的宿主细胞，这些残余DNA可能传递与肿瘤、病毒等相关的基因；当这些重组生物蛋白制品被用于人体后，这些可以整合病毒的DNA在人体内经过表达从而导致癌变等不良后果；因此，宿主DNA残留的检测成为药品监管部门对相关生物制药企业监管的重要内容。
[0003]实时荧光PCR技术是近年发展非常迅速的一种核酸检测技术，通过检测荧光信号的动态变化即时反应PCR的每一循环的扩增水平；其原理：在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能；随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光PCR技术已逐渐取代传统的检测方法，在核酸的检测中得到了十分广泛的应用。但是，目前市面上基于实时荧光PCR技术检测核酸的试剂盒扩增效率都较低，且不稳定；在用于实际操作时，需要操作者在上机检测前进行PCR反应液的配置，该过程繁琐废时，且操作者很难保证不同批配置的反应液是完全一样的，因此，会给实验测试结果带来很大的不稳定性和不可靠性。而现有标准规定的DNA残留量是非常低的，如何研究出一种快速、准确、检测范围宽、检测限低、灵敏度高、可靠性好的检测试剂盒用于CHO细胞中DNA的检测对于临床具有非常重要的实践意义。
[0004]中国专利CN105803050B公开了一种检测CHO细胞DNA的引物及方法，该专利中构筑了5个引物序列使用于PCR荧光体系中，提高实验结果的精密度和灵敏度，并优化了引物的结合位点增加检测方法的特异性，避免假阴性结果；但是该操作方案比较复杂废时，且DNA的检测范围也比较窄。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种CHO残留DNA检测试剂盒，所述试剂盒联合qPCR和荧光检测技术来对CHO细胞中残留的DNA进行定性和定量分析，对抗体/疫苗生产过程进行快速、精准的质量检测。
[0006]进一步地，所述CHO残留DNA检测试剂盒包括以下部分：(1)qPCR扩增反应液，(2)CHO探针和扩增引物的混合液，(3)DNA稀释液，(4)标准定量参考液。
[0007]进一步地，所述扩增引物包括正向引物CHO
‑
F和反向引物CHO
‑
R；所述正向引物CHO
‑
F的序列是5'
‑
AACTCCAGCTATTCGGAAGG
‑
3'，所述反向引物CHO
‑
R的序列为5'
‑
CAGTGGCACAATCTCAGCTCA
‑
3'。
[0008]进一步地，所述CHO探针的序列是5'
‑
TCCTTGAACCCGGGAGGCAGAGG
‑
3'。
[0009]进一步地，CHO探针和扩增引物的混合液中，正向引物CHO
‑
F和反向引物CHO
‑
R的浓
度均为0.05
‑
0.4μmol/L；均优选为0.2μmol/L。
[0010]进一步地，CHO探针和扩增引物的混合液中，CHO探针的浓度为0.1
‑
0.3μmol/L，优选为0.2μmol/L。
[0011]进一步地，所述qPCR扩增反应液包括Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg
2+
。
[0012]进一步地，所述Taq DNA聚合酶在qPCR扩增反应液中的浓度为0.001
‑
0.01U/μL，优选为0.003
‑
0.007U/μL。
[0013]在一种优选的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶在qPCR扩增反应液中的浓度为0.005U/μL。
[0014]进一步地，所述脱氧核糖核苷三磷酸在qPCR扩增反应液中的浓度为0.1
‑
0.9mmol/L，优选为0.3
‑
0.6mmol/L。
[0015]在一种优选的实施方式中，所述脱氧核糖核苷三磷酸在qPCR扩增反应液中的浓度为0.4mmol/L。
[0016]进一步地，所述Mg
2+
在qPCR扩增反应液中的浓度为0.7
‑
1.8mmol/L，优选为1.0
‑
1.5mmol/L。
[0017]在一种优选的实施方式中，所述Mg
2+
在qPCR扩增反应液中的浓度为1.25mmol/L。
[0018]进一步地，所述Mg
2+
的来源为MgCl2。
[0019]进一步地，所述qPCR扩增反应液还包括缓冲溶液，所述缓冲溶液为10x PCR Buffer。
[0020]进一步地，qPCR扩增反应的程序为：
[0021]S1、污染消化：48
‑
52℃处理1.5
‑
3min；
[0022]S2、预变性：93
‑
96℃处理15
‑
30s；
[0023]S3、循环反应：93
‑
97℃处理2
‑
5s，58
‑
65℃处理30s。
[0024]进一步地，所述qPCR扩增反应的程序中，S1污染消化进行1个循环，所述S2预变性处理1
‑
10个循环，所述S3循环反应的循环次数为30
‑
60次。
[0025]在一种优选的实施方式中，所述qPCR扩增反应的程序为：
[0026]S1、污染消化：50℃处理2min；
[0027]S2、预变性：95℃处理20s；
[0028]S3、循环反应：95℃处理3s，60℃处理30s；循环反应重复进行40次。
[0029]进一步地，所述S3的循环反应中，60℃处理30s为荧光收集的步骤。
[0030]进一步地，所述DNA稀释液为5
‑
20mmol/L的Tris
‑
HCl缓冲溶液，缓冲溶液的pH为7.5
‑
8.6。
[0031]进一步地，所述DNA稀释液为8
‑
15mmol/L的Tris
‑
HCl缓冲溶液，缓冲溶液的pH为7.8
‑
8.4。
[0032]在一种优选的实施方式中，所述DNA稀释液为10mmol/L的Tris
‑
HCl缓冲溶液，缓冲溶液的pH为8.0。
[0033]进一步地，所述DNA稀释液还包括0.3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CHO残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述CHO残留DNA检测试剂盒包括以下部分：(1)qPCR扩增反应液，(2)CHO探针和扩增引物的混合液，(3)DNA稀释液，(4)标准定量参考液；所述qPCR扩增反应液包括Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、Mg
2+
。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物包括正向引物CHO
‑
F和反向引物CHO
‑
R；所述正向引物CHO
‑
F的序列是5'
‑
AACTCCAGCTATTCGGAAGG
‑
3'，所述反向引物CHO
‑
R的序列为5'
‑
CAGTGGCACAATCTCAGCTCA
‑
3'。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述CHO探针的序列是5'
‑
TCCTTGAACCCGGGAGGCAGAGG
‑
3'。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶在qPCR扩增反应液中的浓度为0.001
‑
0.01U/μL，脱氧核糖核苷三磷酸在qPCR扩增反应液中的浓度为0.1
‑
0.9mmol/L，Mg
2+
在qPCR扩增反应液中的浓度为0.7
‑
1.8mmol/L。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶在qPCR扩增反应液中的浓度为0.003
‑
0.007U/μL，脱氧核糖核苷三磷酸在qPCR扩增反应液中的浓度为0.3
‑
0.6mmol/L，Mg
2+
在qPCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：许金超，栗红建，张丹，李永锋，刘丽美，张伟男，蔡宇卿，郭彬彬，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：