【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，特别涉及一种针对nk细胞的慢病毒纯化的方法及其应用。
技术介绍
1、慢病毒是由人类免疫缺陷病毒（hiv），通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而来。nk使用的复制缺陷型hiv载体通常用狒狒内源性病毒（baboon endogenousvirus）的包膜来代替hiv-1的包膜进行包装，从而更安全，宿主范围更广，还能增加病毒的滴度。目前，基因治疗已经被广泛用于治疗囊性纤维化、血友病、肌营养不良症和镰状细胞贫血等基因遗传性疾病、血液病，以及肿瘤疾病当中。
2、慢病毒上游的生产工艺一般采用hek293细胞进行瞬时转染或构建稳定生产细胞系的方式进行生产，细胞的培养方式可以分为贴壁培养和悬浮培养。慢病毒下游的生产工艺路线一般先通过澄清（离心或过滤）去除大的细胞、细胞碎片及部分杂质，然后通过超滤系统对病毒进行浓缩、溶液置换及部分杂质的去除，再经过核酸酶（一般为benzonase）的消化去除部分残留核酸，最后通过二次超滤、层析等技术对慢病毒进一步进行纯化。不过传统纯化方法对杂质去除能力较差，整体的回收率较低。
3、因此，为解决这个难题，需要开发一种针对nk细胞的慢病毒纯化的方法及其应用，为解决未来基因治疗中所需的病毒载体提供了一种高效率的生产方案。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种针对nk细胞的慢病毒纯化的方法及其应用，提高针对nk细胞慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
2、为实现上
3、1）将慢病毒收获液和核酸酶孵育，浓缩换液后继续加入核酸酶孵育，得到慢病毒澄清收获液；
4、2）对慢病毒澄清收获液采用复合模式层析，获得粗纯样品；
5、3）对粗纯样品进行阴离子层析，无菌过滤后得到纯化样品。
6、在一些实施方式中，步骤1）中，慢病毒收获液和核酸酶孵育前先进行慢病毒收获液的过滤，所述过滤采用囊氏过滤器进行。
7、在一些实施方式中，步骤1）中，所述浓缩采用tff浓缩系统进行。
8、在一些实施方式中，步骤1）中，所述换液的缓冲液为pbs；所述换液的缓冲液中还包括1~2m mgcl2。
9、在一些实施方式中，步骤2）中，所述复合模式层析的填料选自capto core 700或capto core 400。
10、在一些实施方式中，步骤3）中，所述阴离子层析选自deae层析。
11、在一些实施方式中，deae层析时，粗纯样品的上样量不超过0.5cv。
12、在一些实施方式中，deae层析包括以下步骤：
13、1）平衡：用4~6cv的缓冲液a冲洗deae层析柱；
14、2）上样：将粗纯样品上样；
15、3）清洗：用2~4cv的缓冲液a冲洗deae层析柱；
16、4）洗杂：用2~4cv的第一混合缓冲液冲洗deae层析柱，所述第一混合缓冲液包括缓冲液a和缓冲液b；以第一混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液b的体积分数为0~30%；
17、5）洗脱：用2~4cv的第二混合缓冲液冲洗deae层析柱，获得层析后的样品；所述第二混合缓冲液包括缓冲液a和缓冲液b；以第二混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液b的体积分数为30~100%。
18、在一些实施方式中，粗纯样品的上样体积为80%动态结合载量；所述动态结合载量通过将粗纯样品通过uv检测池计算得到。
19、在一些实施方式中，缓冲液b的组分包括15~25mm tris-hcl和0.8~1.2m nacl；所述缓冲液a的组分包括15~25mm tris-hcl和140~150mm nacl。
20、在一些实施方式中，以第一混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液b的体积分数为15%，缓冲液a的体积分数为85%。
21、在一些实施方式中，以第二混合缓冲液的总体积为基准，缓冲液b的体积分数为60%，缓冲液a的体积分数为40%。
22、在一些实施方式中，洗脱后进行最后的清洗，包括用2cv的清洗液冲洗deae层析柱，所述清洗液包括0.8~1.2m naoh和0.8~1.2m nacl。
23、与现有技术相比，本申请的有益效果为：
24、本申请的纯化方法通过选择两种层析方式，包括复合模式层析和阴离子层析，并优化阴离子层析时所用的缓冲液配方，从而提高慢病毒纯化的回收率和杂质的去除能力。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种针对NK细胞的慢病毒纯化的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，慢病毒收获液和核酸酶孵育前先进行慢病毒收获液的过滤，所述过滤采用囊氏过滤器进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述浓缩采用TFF浓缩系统进行。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述换液的缓冲液为PBS；所述换液的缓冲液中还包括1~2M MgCl2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述复合模式层析的填料选自Capto core 700或Capto core 400。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，DEAE层析时，粗纯样品的上样量不超过0.5CV。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗纯样品的上样体积为80%动态结合载量；所述动态结合载量通过将粗纯样品通过UV检测池计算得到。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱后进行最后的清洗，包括用2CV的清洗液冲洗DEAE层析柱，所述清洗液包括0.8~1.2M N
...【技术特征摘要】
1.一种针对nk细胞的慢病毒纯化的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，慢病毒收获液和核酸酶孵育前先进行慢病毒收获液的过滤，所述过滤采用囊氏过滤器进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述浓缩采用tff浓缩系统进行。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述换液的缓冲液为pbs；所述换液的缓冲液中还包括1~2m mgcl2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述复合模式层...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑孟韬，栗红建，张丹，赵圆，李朝晖，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。