【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及ipc c12q1，更具体地涉及，一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒及使用方法。
技术介绍
1、随着现代生物技术的不断发展，生物制剂在临床研究、实验研究方面的应用越来越广，对生物制剂的质量的要求越来越高。
2、在生物制剂生产过程中，容易被实验环境、操作者鼻腔口腔、实验器材等地方的支原体污染，从而影响生物制品的质量，因此支原体dna的检测是生物制品的重要质控标准。
3、现有专利cn201611225518.0公开了一种猪肺炎支原体的实时荧光pcr检测试剂盒及其用途，针对猪肺炎支原体p46基因序列设计的taqman荧光探针及引物，该试剂盒能够特异性地检测猪肺炎支原体，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。但该试剂盒只适用于一种支原体的检测，且适用于特定场所。无法全面检测生物制剂中大部分支原体。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的问题，本专利技术第一方面提供了一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，包括buffer、引物-探针混合物、内控、阳性模板、无菌水；所述引物-探针混合物包括支原体引物、支原体探针、内控引物和内控探针；所述引物和探针序列包括seq idno.1～6。
2、优选的，所述的buffer包括氯化钾、tris-hcl、氯化镁；进一步优选的，包括400～600mm氯化钾、80～120mm tris-hcl、10～20mm氯化镁。
3、在一种优选的方案中，所述
4、优选的，所述引物-探针混合物包括8～12μm浓度的支原体引物、8～12μm浓度的支原体探针、8～12μm浓度的内控引物和8～12μm浓度的内控探针；进一步优选的，为10μm浓度的支原体引物、10μm浓度的支原体探针、10μm浓度的内控引物和10μm浓度的内控探针。
5、优选的，所述支原体引物包括支原体上游引物和支原体下游引物；所述内控引物包括内控上游引物和内控下游引物。
6、优选的，所述支原体上游引物为seq id no.1：atgcatcagtacctgag；所述支原体下游引物为seq id no.2：tacgtcgccaacttctgc；所述支原体探针序列为seq id no.3：gtttctcggcaagtgaacgcca；n端与fam基团相连、c端与bhq1基团相连。
7、优选的，所述内控上游引物为seq id no.4：taacatgctcgagggccttac，所述内控下游引物为seq id no.5：tgccttagcagtgccctgtc；所述内控探针序列为seq id no.6：tccacccgtagggagcgtcaac；n端与hex基团相连、c端与bhq1基团相连。
8、优选的，所述支原体包括口腔支原体、关节液支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、发酵支原体、柠檬螺原体、肺炎支原体、唾液支原体。
9、本专利技术中，通过特定的引物和探针，能特异性扩增ep2.6.7和jp xvii中提到的口腔支原体、关节液支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、发酵支原体、柠檬螺原体、肺炎支原体、唾液支原体10中支原体，而对其它生物制剂中常见的污染细菌和基因组无扩增现象，减少了其它因素对检测结果的影响，提高了检测试剂盒的准确性。本专利技术人通过对ep2.6.7和jp xvii中10种支原体的研究，创造性地设计了特定的上游引物、下游引物和探针，该特定的上游引物、下游引物和探针与10种支原体匹配性和特异性能好，且具有高度保守的特异荧光探针，引物在进行扩增的过程中，探针发生酶解，能够使荧光积累从而被仪器检测到，并且与其他常见的污染源无交叉。
10、优选的，所述内控的碱基序列为seq id no.7：aacatgctcgagggccttacggcccccgtgggatgctcctacatgtcagga acagttactgacgtaataacgggtgagtccatcataagcgttgacgctccc tacgggtggactgtggagagacagggcactgctaaggc。
11、优选的，所述阳性模板的碱基序列为seq id no.8：gaaaggcgcgcgatacagggtgacagccccgtacacaaaaatgcacatgc tgtgagctcgatgagtagggcgggac。
12、本专利技术中，通过设置特定的内控和阳性模板，从而提高试剂盒检测的准确度。本专利技术人发现，当检测特定的10种支原体时，需要有特定的内控和阳性模板作为对照，当内控和阳性模板的碱基序列不恰当，容易导致检测的灵敏度计准确性。本专利技术人创造性地设计了内控和阳性模板，能相对定量的测出目的支原体的相对表达量。同时，特异性地设计了阳性对照，含有10种支原体共有序列，进而提高了试剂盒检测的准确性。
13、优选的，所述无菌水为纯净水。
14、优选的，所述本专利技术中的碱基序列由生工、金唯智国内生物合成公司合成。
15、目前，市面上售卖的试剂盒的标准品的扩增效率都较低，且不稳定，且在用于实际操作时，需要操作者在上机检测前进行pcr反应液的配置，该过程繁琐，且操作者很难保证不同批配置的反应液是完全一样的，若是用于比较样品的前后差异，其数据可靠性难以让人信服。本专利技术中采用的试剂盒简化qpcr反应操作的反应液配置时的操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。
16、本专利技术第二方面提供了一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒的使用方法，包括配制预混液，加入反应孔、设置qpcr程序、结果判定。
17、所述支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒的具体使用方法，具体步骤为：
18、s1：配制预混液：将各试剂于冰上融解，buffer试剂上下颠倒轻轻混匀后轻轻离心，其他试剂涡旋混匀后轻微离心；按照表1的组分配制预混液。
19、s2：加入反应孔：按照表2分组，将对应的模板加入到反应孔底部；
20、s3：设置qpcr程序：选择双通道水解探针法程序(fam为支原体检测通道、hex为内控检测通道)设置反应程序，见表3
21、s4：结果判定：阳性：fam通道和hex通道都有扩增曲线，fam通道的ct值小于40；
22、阴性：hex通道都有扩增曲线，fam通道没有扩增曲线，fam通道的ct值大于40；
23、无效结果：hex通道没有扩增曲线，ct值大于40；
24、表1
25、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括Buffer、引物-探针混合物、内控、阳性模板、无菌水；所述引物-探针混合物包括支原体引物、支原体探针、内控引物和内控探针；所述引物和探针序列包括SEQ ID NO.1～6。
2.根据权利要求1所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的Buffer包括氯化钾、Tris-HCl、氯化镁。
3.根据权利要求2所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的Buffer包括400～600mM氯化钾、80～120mM Tris-HCl、10～20mM氯化镁。
4.根据权利要求1所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述支原体引物包括支原体上游引物和支原体下游引物；所述内控引物包括内控上游引物和内控下游引物。
5.根据权利要求4所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述支原体上游引物为SEQ ID NO.1：ATGCATCAGTACCTGAG；所述支原体下游引物为SEQ ID NO.2：TACGTCGCCAACT
6.根据权利要求4所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内控上游引物为SEQ ID NO.4：TAACATGCTCGAGGGCCTTAC，所述内控下游引物为SEQ ID NO.5：TGCCTTAGCAGTGCCCTGTC；所述内控探针序列为SEQ ID NO.6：TCCACCCGTAGGGAGCGTCAAC；N端与HEX基团相连、C端与BHQ1基团相连。
7.根据权利要求1所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述支原体包括口腔支原体、关节液支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、发酵支原体、柠檬螺原体、肺炎支原体、唾液支原体。
8.根据权利要求1所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内控的碱基序列为SEQ ID NO.7：AACATGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGA ACAGTTACTGACGTAATAACGGGTGAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCC TACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGC。
9.根据权利要求1所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性模板的碱基序列为SEQ ID NO.8：GAAAGGCGCGCGATACAGGGTGACAGCCCCGTACACAAAAATGCACATGCTGTGAGCTCGATGAGTAGGGCGGGAC。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述的支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括配制预混液，加入反应孔、设置qPCR程序、结果判定。
...【技术特征摘要】
1.一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，包括buffer、引物-探针混合物、内控、阳性模板、无菌水；所述引物-探针混合物包括支原体引物、支原体探针、内控引物和内控探针；所述引物和探针序列包括seq id no.1～6。
2.根据权利要求1所述的支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述的buffer包括氯化钾、tris-hcl、氯化镁。
3.根据权利要求2所述的支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述的buffer包括400～600mm氯化钾、80～120mm tris-hcl、10～20mm氯化镁。
4.根据权利要求1所述的支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述支原体引物包括支原体上游引物和支原体下游引物；所述内控引物包括内控上游引物和内控下游引物。
5.根据权利要求4所述的支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述支原体上游引物为seq id no.1：atgcatcagtacctgag；所述支原体下游引物为seq id no.2：tacgtcgccaacttctgc；所述支原体探针序列为seq id no.3：gtttctcggcaagtgaacgcca；n端与fam基团相连、c端与bhq1基团相连。
6.根据权利要求4所述的支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述内控上游引物为seq id no.4：taacatgctcgagggccttac，所述内...
【专利技术属性】
技术研发人员：许金超，栗红建，张丹，李永锋，刘丽美，张伟男，蔡宇卿，郭彬彬，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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