【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，特别涉及一种针对nk细胞的慢病毒的制备时所用的细胞培养的方法及其应用。
技术介绍
1、目前临床上的基因治疗载体以病毒性载体为主，主要的病毒载体包含腺病毒、溶瘤病毒和逆转录病毒。其中逆转录病毒载体，常用的包括γ逆转录病毒和慢病毒载体，被用于将基因稳定导入哺乳动物细胞的临床研究已有近30年。逆转录病毒可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。
2、慢病毒载体属于逆转录病毒的一种，相比于其他逆转录病毒，慢病毒载体具有更广的宿主范围，能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。而且慢病毒载体是以人类免疫缺陷i型病毒(hiv)为基础改造的基因治疗载体，来自hiv-1的慢病毒载体，由于可以承载较大的外源目的基因片段，能够感染非分裂期细胞，在体内能够稳定整合，并且较少发生基因沉默现象。且对于一些较难感染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，增加目的基因整合到宿主细胞基因组的几率，从而能够比较方便快捷地实现目的基因长期、稳定表达。慢病毒载体以及免疫反应小，安全性较好等优点，在临床研究中得到广泛应用，尤其是第3代自身缺陷型慢病毒载体，具有极高的生物安全性。
3、随着研究从基础向临床阶段的发展，对慢病毒的需求量也大大增加，常规的慢病毒生产方法已难以满足，迫切需要能够大规模生产高质量的满足临床需求的慢病毒制备方案。常规的慢病毒制备法在准备产毒用细胞时并没有规定具体的传代时间，细胞不一定在最佳的生长状态。常规方法对培养基的选择也没有做过深入的研究，
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种针对nk细胞的慢病毒的制备时所用的细胞培养的方法及其应用，用于解决现有技术中的问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种利于慢病毒包装的细胞的培养方法，包括以下步骤：
3、1)复苏293t细胞；
4、2)将步骤1)的293t细胞进行扩增培养，使细胞密度在(4.0～8.0)×106cells/ml，细胞活率不低于90％；扩增的培养基选自dynamis；扩增时二氧化碳浓度为5-6％；
5、3)将步骤2)的细胞传代培养，使得活细胞密度达到(6.0±1.0)×106cells/ml，细胞活率不低于90％，得到适合进行慢病毒包装的细胞。
6、在一些实施方式中，步骤1)中，所述复苏是在水浴条件下进行孵育。
7、在一些实施方式中，复苏的条件为：水浴温度35-40℃；水浴时间100-120s。
8、在一些实施方式中，复苏还包括摇床培养，复苏的培养基选自dynamis；摇床培养的条件为：摇床温度37±2℃；摇床转速100±10rpm；摇床中的二氧化碳浓度5-6％；摇床培养时间72±2h。
9、在一些实施方式中，复苏的培养基还包括谷氨酰胺，以所述复苏的培养基的总体积为基准，所述谷氨酰胺的添加量为6±1mm。
10、在一些实施方式中，步骤2)中，扩增时的接种密度为0.5±0.05×106cells/ml。
11、在一些实施方式中，步骤2)中，扩增是在摇床中进行；所述摇床的温度为37±2℃；摇床的转速为90±10rpm；摇床培养时间72±2h。
12、在一些实施方式中，步骤3)中，所述传代培养的时间为72±2天。
13、在一些实施方式中，步骤2)中，扩增是在摇床中进行；所述摇床的温度为37℃；摇床的转速为90rpm；摇床培养时间72h。
14、在一些实施方式中，步骤3)中，所述传代培养的时间为72天。
15、本申请第二方面提供一种细胞，采用前述的培养方法培养获得。
16、本申请第三方面提供前述的细胞在慢病毒包装中的应用。
17、与现有技术相比，本申请的优势效果体现在：
18、1、本申请通过控制细胞扩增的参数，包括培养基、二氧化碳的浓度，使得活细胞密度达到(4.0～8.0)×106cells/ml，细胞活率不低于90％。
19、2、本申请通过传代培养，传代培养的时间为72±2h，使得活细胞密度达到(6.0±1.0)×106cells/ml，细胞活率不低于90％，得到适合进行慢病毒包装的细胞，本申请对转染前的传代时间进行了研究，确定了较优的传代范围。
20、3、最终，本申请提高了细胞培养后的活率和传代的稳定性，进一步提高产毒效率。
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1.一种利于慢病毒包装的细胞的培养方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述复苏是在水浴条件下进行孵育。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述复苏的条件为：水浴温度35-40℃；水浴时间100-120s。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，复苏还包括摇床培养，复苏的培养基选自Dynamis；摇床培养的条件为：摇床温度37±2℃；摇床转速100±10rpm；摇床中的二氧化碳浓度5-6％；摇床培养时间72±2h。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述复苏的培养基还包括谷氨酰胺，以所述复苏的培养基的总体积为基准，所述谷氨酰胺的添加量为6±1mM。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中，扩增时的接种密度为0.5±0.05×106cells/mL；
7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中，扩增是在摇床中进行；所述摇床的温度为37℃；摇床的转速为90rpm；摇床培养时间72h。
8.如权利要求6所述的培
9.一种细胞，采用如权利要求1～8任一项所述的培养方法培养获得。
10.如权利要求9所述的细胞在慢病毒包装中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种利于慢病毒包装的细胞的培养方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述复苏是在水浴条件下进行孵育。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述复苏的条件为：水浴温度35-40℃；水浴时间100-120s。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，复苏还包括摇床培养，复苏的培养基选自dynamis；摇床培养的条件为：摇床温度37±2℃；摇床转速100±10rpm；摇床中的二氧化碳浓度5-6％；摇床培养时间72±2h。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述复苏的培养基还包括谷氨酰胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑孟韬，栗红建，张丹，赵圆，李朝晖，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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