一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒及提取方法，提取试剂盒包括裂解液、绑定液、漂洗液1、漂洗液2以及洗脱液，其中：所述裂解液包括盐酸胍、乙二胺四乙酸、吐温20、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮；所述绑定液包括氯化锂和乙醇；所述漂洗液1包括异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸；所述漂洗液2包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙醇；所述洗脱液为无核酸酶水。该提取试剂盒及提取方法，采用裂解液裂解藻类细胞，整个提取过程中无需用到酚、氯仿等有机物抽提和盐沉淀步骤，操作简单、安全、快捷，提取效果稳定良好，适配多种类的单细胞藻，可以适配多类磁棒法全自动核酸提取设备，样本处理通量高。样本处理通量高。样本处理通量高。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术属于藻类RNA提取
，具体涉及一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒及提取方法。

技术介绍

[0002]藻类是原生生物中一类能够进行光合作用的水生生物，藻类中成员广泛，形态各异，既有微小的微单胞菌，也有长达60米的大型藻类。藻类细胞中的光合作用元件相对于植物而言更为多样，其细胞也有区别于动植物细胞的独立特点。藻类在生态系统中通常是氧气制造者，并作为大多数水生生物捕食的场所，同时，藻类也是原油和人类食物的来源，其加工品是药品和工业的重要原料。微藻是藻类中一类单细胞藻，藻体为单个细胞或多细胞群体，其细胞类型为原核或双核，有文献将微藻等同于浮游生物。人类发现、开发单细胞藻类已有上千年历史，其在多个领域具有巨大的潜在利用价值，除作为人类和动物的食品外，单细胞藻类富含类胡萝卜素、藻胆蛋白等物质，被用来作为药品、生物染料、化肥等生产的原料，同时，因其在营养丰富的环境中较强的养分吸收、积累金属离子的能力，也被用于水域治废治污和固碳降碳。
[0003]蓝藻、绿藻、小球藻等单细胞藻类长期以来是发育生物学、分子生态学等基础研究学科重要的研究材料，对单细胞藻类的基因表达研究手段，包括Northern杂交、芯片杂交、RT
‑
PCR和cDNA文库构建等，首先需要从材料中获取高质量的总RNA。单细胞藻富含酚类、脂质、多糖和内生的RNA酶等，有文献表明在低盐离子浓度的缓冲液中多糖容易和RNA共同聚沉，这使得分离提取高纯度、高完整度的总RNA十分困难。/>[0004]传统的提取方法针对性不强，效果不佳，RNA得率较低，且样本处理通量有限；目前市面上针对单细胞藻类的总RNA提取试剂盒较少，中国专利CN102807978一种藻类RNA提取剂及使用方法和中国专利CN115678891一种微藻菌细胞总RNA的提取方法，这两种藻类RNA的提取方案中都要用到氯仿，存在一定的试验安全隐患。因此，开发一种安全系数高，提取效率高而且提取效果好的单细胞藻类总RNA提取试剂盒及提取方法是很有必要。

技术实现思路

[0005]针对目前所存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒及提取方法，无需机械研磨和高温孵育裂解，无需用到酚、氯仿等有机物抽提和盐沉淀步骤，提高实验安全性，操作简单快捷，提取效果稳定良好，适用于多种类的单细胞藻。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术手段：
[0007]本专利技术的第一方面在于提供一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒，包括裂解液、绑定液、漂洗液1、漂洗液2以及洗脱液，其中：
[0008]所述裂解液包括盐酸胍、乙二胺四乙酸、吐温20、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮；
[0009]所述绑定液包括氯化锂和乙醇；
[0010]所述漂洗液1包括异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸；
[0011]所述漂洗液2包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙醇；
[0012]所述洗脱液为无核酸酶水。
[0013]进一步地，所述裂解液中，盐酸胍终浓度为4
‑
8mol/L、乙二胺四乙酸终浓度为25
‑
100mmol/L、吐温20终浓度为1
‑
2.5％、二硫苏糖醇终浓度为20
‑
50mmol/L和聚乙烯吡咯烷酮终浓度为1
‑
2.5％。
[0014]进一步地，所述绑定液中，氯化锂终浓度为6
‑
12mol/L，乙醇终浓度为50
‑
85％。
[0015]进一步地，所述漂洗液1中，异硫氰酸胍终浓度为1
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5mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐终浓度为10
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20mmol/L，乙二胺四乙酸终浓度为5
‑
20mmol/L。
[0016]进一步地，所述漂洗液2中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐终浓度为10
‑
20mmol/L，乙醇终浓度为50
‑
85％。
[0017]本专利技术的第二方面在于提供一种前文所述的单细胞藻类总RNA提取试剂盒进行RNA提取的方法，包括如下步骤：
[0018]S1，取藻类样本置于样本管a中，加入裂解液，涡旋振荡混匀3
‑
5分钟，将藻体细胞分散悬浮至无结块；
[0019]S2，室温静置3
‑
7分钟，随后4℃，12000g，高速离心2
‑
5min；离心后移取上清液到样本管b中；
[0020]S3，向样本管b中加入5
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15μL磁珠悬液和350
‑
450μL绑定液，置于混匀仪上，室温振荡混匀5
‑
7min，随后将样本管b放置在磁力架上，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；
[0021]S4，向完成S3的容器b中加入550
‑
650μL漂洗液1，将容器b从磁力架上转移到混匀仪上，振荡混匀30
‑
90s，在磁力架上静置，磁珠完全吸附后，弃上清；
[0022]S5，向完成S4的容器b中加入550
‑
650μL漂洗液2，将容器b从磁力架上转移到混匀仪上，振荡混匀30
‑
90s，在磁力架上静置，磁珠完全吸附后，弃上清，室温下晾干；
[0023]S6，向晾干的容器b中加入40
‑
60μL洗脱液，放置在磁力架上静置2
‑
4min，然后转移到混匀仪上，振荡混匀3
‑
7min；
[0024]S7，将完成S6的容器b置于磁力架上静置2
‑
5min，磁珠完全吸附后，将上清溶液转至容器c中，容器c中的上清液即为提取得到的RNA产物，
‑
80℃保存。
[0025]进一步地，所述藻类样本为单细胞藻类样本。
[0026]此方法中，藻体经过富集收集，通过裂解液裂解的方式将RNA从藻类细胞中释放出来，并与含量丰富的次级代谢物分离，离心去除难溶的杂质，吸取上清液使用醇类绑定液聚沉其中的RNA，并与硅基磁珠结合，随后进入全自动化RNA制备流程，经过两次漂洗除去盐类、酚类等杂质，最终使用无核酸酶水洗脱，得到提纯的RNA产物。
[0027]本专利技术的有益效果
[0028]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术该方法不经机械研磨和高温孵育裂解，而是采用裂解液裂解藻类细胞，整个提取过程中无需用到酚、氯仿等有机物抽提和盐沉淀步骤，操作简单、安全、快捷，提取效果稳定良好，适配多种类的单细胞藻；并且该藻类RRNA提取试剂盒和提取方法是基于磁珠纯化的方式，可以适配多类磁棒法全自动核酸提取设备，能够实现更高的样本处理通量，提取效率高。
附图说明
[0029]图1示出了本专利技术对比例1样本1
‑
12的DNA凝胶电泳图；
[0030]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒，其特征在于：包括裂解液、绑定液、漂洗液1、漂洗液2以及洗脱液，其中：所述裂解液包括盐酸胍、乙二胺四乙酸、吐温20、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮；所述绑定液包括氯化锂和乙醇；所述漂洗液1包括异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸；所述漂洗液2包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙醇；所述洗脱液为无核酸酶水。2.根据权利要求1所述的一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液中，盐酸胍终浓度为4
‑
8mol/L、乙二胺四乙酸终浓度为25
‑
100mmol/L、吐温20 终浓度为1
‑
2.5％、二硫苏糖醇终浓度为20
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50mmol/L和聚乙烯吡咯烷酮终浓度为1
‑
2.5％。3.根据权利要求1所述的一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒，其特征在于：所述绑定液中，氯化锂终浓度为6
‑
12mol/L，乙醇终浓度为50
‑
85％。4.根据权利要求1所述的一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒，其特征在于：所述漂洗液1中，异硫氰酸胍终浓度为1
‑
5mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐终浓度为10
‑
20mmol/L，乙二胺四乙酸终浓度为5
‑
20mmol/L。5.根据权利要求1所述的一种单细胞藻类总RNA提取试剂盒，其特征在于：所述漂洗液2中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐终浓度为10
‑
20mmol/L，乙醇终浓度为50
‑
85％。6.一种利用权利要求1
‑
5任一项所述的单细胞藻类总RNA提取试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡霖霖，邓阳红，殷楠楠，陈雪莲，
申请(专利权)人：杭州联川基因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：