基于制造技术

本发明专利技术属于基于多重核酸分析的生物学检测技术领域，具体涉及一种基于

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
‑
Cas的多重核酸扩增熔解检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于基于多重核酸分析的生物学检测
，具体涉及一种基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增的熔解检测方法及试剂盒
。

技术介绍

[0002]聚类规则间隔的短回文重复序列
(Clustered Regular Interspaced Short Palinrepeats
，
CRISPR)
技术具有温和的反应温度
、
优异的识别特异性和高效的信号放大能力等显著特点
。
具有代表性的核酸分析包括
Cas12aVDet、DETECTR
等方法，然而，现有技术中仍存在诸多问题，如
(Analytical Chemistry,2019,91(19):12156
‑
12161
；
Science,2018,360(6387):436
‑
439)
，该技术存在着与核酸扩增技术结合带来交叉污染
、
检测目标有限等问题
。
为了实现多重核酸检测，
Zhang
等人基于
LwaCas13a、CcaCas13b、LbaCas13a
和
PsmCas13b
对
AU、UC、AC
和
GA
碱基的切割偏好，开发了一种多重和便携式核酸检测平台
。
但仍存在目标数量受限于蛋白种类
、
信号交叉与泄露
、
需要专用荧光通道
、
成本较高等问题
。
[0003]另一种更容易的策略是通过操纵空间分离来使用多通道设计，该方案可以避免干扰
CRISPR/Cas。
例如，利用
CARMEN(
用于核酸多重评估的组合阵列反应
)
和
Cas13
平台的组合允许使用自组织和微型微流体技术进行大规模检测
。(Nature 2020,582,277.)Dincer
等人已经设计了一种电化学微流体生物传感器，其中固定区域被分离成多个分段，以实现多个靶标的并行检测
。
然而，这些策略需要熟练的人员和复杂的预处理过程等
。(Biosens.Bioelectron.2021,177,112887.)。
尽管研究人员已经设计了多种实现多重核酸检测的方法，但想要实现简便，低成本的检测仍有巨大的空间
。
[0004]熔解曲线技术利用
DNA
熔解温度的特异，同时分析多种扩增子，是一种方便
、
可扩展
、
可靠
、
闭管和低成本高效益的方法，但是难以区分非特异性扩增以及熔解温度
(Tm)
没有明显差异的不同靶标
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解检测方法及试剂盒，用以克服现有技术中存在的多重核酸检测的检测目标数量受限于蛋白种类
、
成本高
、
空间分割操作复杂等缺点
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解检测方法，利用
Cas12a
或者
Cas9
蛋白对待测
DNA
进行特异性顺式切割，切割得到的
DNA
片段长度和
GC
比例发生改变，从而导致
Tm
值发生改变，再进行熔解检测实验，并用荧光染料或荧光标记来表征熔解峰，实现多重核酸的检测
。
[0008]进一步地，上述方法具体包括以下步骤：
[0009](1)
将多对引物模板的多重
PCR
反应或多重
LAMP
反应试剂添加至反应管进行扩增反应；
[0010](2)
扩增结束后将所得物与
CRISPR
‑
Cas
混合，进行特异性的水解切割反应；
[0011](3)
将所得切割产物进行熔解分析，采用荧光染料或荧光标记进行信号输出，根据熔接峰位置鉴别扩增产物中的多种靶标来源
。
[0012]基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解分析试剂盒：盒内包括有用于建立
CRISPR
‑
Cas12a
多重
PCR
体系的
Taq PCR Mix、20
×
EvaGreen、10
μ
M DTT、4
×
201buffer、1
μ
M Cas12a
或者
Cas9
；
[0013]使用时：向
10
μ
L PCR
反应管，依次加入5μ
LTaq PCR Mix、1
μ
L
待测
DNA
，
0.2
μ
M DNA
引物
、1
×
EvaGreen
，或直接加入荧光标记的
DNA
引物，同时设置无模板的空白对照，
95℃
预变性
5min
，扩增程序为
95℃
变性
15s
，
57℃
退火
15s
，
68℃
延伸
30s
，进行扩增反应，后取出1μ
L PCR
产物加入到含有1μ
M DTT、1
×
201buffer、0.3
μ
M Cas12a
或者
Cas9、0.3
μ
M crRNA
的
10
μ
L
反应体系中
、
震荡混合均匀反应体系，短暂离心后在
65
‑
95℃
进行熔解分析
。
[0014]基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解分析试剂盒：盒内包括有用于建立
CRISPR
‑
Cas
多重
LAMP
体系的
10
×
Buffer 2.1、10mM dNTP、5M
甜菜碱
、100mM MgSO4、8000U/ml Bst DNA Polymerase、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解检测方法，其特征在于：利用
Cas12a
或者
Cas9
蛋白对待测
DNA
进行特异性顺式切割，切割得到的
DNA
片段长度和
GC
比例发生改变，从而导致
Tm
值发生改变，再进行熔解检测实验，并用荧光染料或荧光标记来表征熔解峰，实现多重核酸的检测
。2.
根据权利要求1所述的基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)
将多对引物模板的多重
PCR
反应或多重
LAMP
反应试剂添加至反应管进行扩增反应；
(2)
扩增结束后将所得物与
CRISPR
‑
Cas
混合，进行特异性的水解切割反应；
(3)
将所得切割产物进行熔解分析，采用荧光染料或荧光标记进行信号输出，根据熔接峰位置鉴别扩增产物中的多种靶标来源
。3.
基于
CRISPR
‑
Cas
的多重核酸扩增熔解分析试剂盒，其特征在于：盒内包括有：用于建立
CRISPR
‑
Cas
多重
PCR
体系的
Taq PCR Mix、20
×
EvaGreen、10
μ
M DTT、4
×
201buffer、1
μ
M Cas12a
或者
Cas9
；使用时：向
10
μ
L PCR
反应管，依次加入5μ
LTaq PCR Mix、1
μ
L
待测
DNA
，
0.2
μ
M DNA
引物
、1
×
EvaGreen
，或直接加入荧光标记的
DNA
引物，同时设置无模板的空白对照，
95℃
预变性
5min
，扩增程序为
95℃
变性
15s
，
57℃
退火
15s
，
68℃
延伸
30s
，进行扩增反应，后取出1μ
L PCR

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，刘昊，澹台玮，周凯乐，毛国斌，杨雨昕，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：