一种简便高效的短片段ssDNA琼脂糖凝胶回收方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种短片段ssDNA琼脂糖胶回收方法，该方法包括如下步骤：ssDNA上样于琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖胶中的ssDNA条带切块，装入带有内套管的离心柱中，离心后得到离心液；在离心液中加入氨基修饰的磁性粒子，在高温下对ssDNA进行吸附；磁性分离后，在磁性粒子中加入带有磷酸根的试剂，高温下解吸附，磁性分离后就即得到ssDNA。本发明专利技术的ssDNA提取方法步骤简单，操作极为简单，而且经过与市售胶回收试剂盒对比具有更高的回收率。剂盒对比具有更高的回收率。剂盒对比具有更高的回收率。

【技术实现步骤摘要】
一种简便高效的短片段ssDNA琼脂糖凝胶回收方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种适于短片段ssDNA琼脂糖凝胶回收的方法及其应用。

技术介绍

[0002]短片段单链DNA(ssDNA)琼脂糖凝胶回收目前使用的仍然是商品化的DNA胶回收试剂盒，但是商品化试剂盒主要目的是对PCR产物进行TA克隆，这些往往都是片段较大的双链DNA(dsDNA)。对于短片段ssDNA的胶回收使用大片段dsDNA胶回收的方法往往会导致回收率较低。而在一些应用中，ssDNA的高效回收极为重要。如适配体筛选，如果在回收过程中大量的ssDNA丢失，则其后无论多少轮的筛选都可能都得不到亲和力较高的适配体序列。
[0003]因此，需要开发专门针对短片段ssDNA的胶回收方法，以满足此类需求。

技术实现思路

[0004]为解决以上短片段单链DNA无法高效回收的问题，本申请提供一种简便高效的短片段ssDNA琼脂糖凝胶回收方法，包括以下步骤：
[0005](1)切胶：ssDNA上样于琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖凝胶上对应的ssDNA条带切块；
[0006](2)离心：将步骤(1)得到的胶块加入带有内套管的纯化柱中，10000
‑
14000rpm离心10
‑
40min，收集管底离心液；
[0007](3)磁性吸附：将10
‑
200μg的氨基修饰的磁性粒子加入到离心液中，60
‑
100℃下混合10
‑
>30min；
[0008](4)解吸附：将含有磷酸根的溶液加入到磁性复合物中，60
‑
100℃下混合10
‑
30min；磁性分离，吸取上清液即为目标ssDNA。
[0009]本专利技术直接用离心套件高速离心胶块，随后用氨基化磁性纳米粒子吸附其中的短片段ssDNA，然后用含有磷酸根的溶液进行洗脱，即可得到短片段ssDNA。本专利技术的ssDNA琼脂糖凝胶回收方法，步骤简单，仅仅需要切胶、离心、吸附、解吸附四个步骤。传统的方法往往需要极为繁琐的步骤，甚至有些方法还要用到氯仿、异戊醇等有机溶剂。尤为重要的是，传统方法往往主要针对较长的dsDNA，故直接将此类试剂盒用于短链ssDNA胶回收往往效果不佳。经过验证，对于小于120nt的短链ssDNA的琼脂糖凝胶回收，本专利技术的回收率显著高于目前市售的国内外胶回收产品。
[0010]本专利技术的方法适用10
‑
120nt的单链DNA的回收，例如120nt、110nt、100nt、95nt、90nt、85nt、80nt、75nt、70nt、65nt、60nt、55nt、50nt、45nt、40nt、30nt、20nt、10nt。在一种具体实施方式中，对步骤(1)切胶时对胶块形状或者大小无具体要求，不切到其他条带即可；因为是短片段ssDNA，较为容易通过离心甩出。此外，因为是磁性吸附，所以对甩出液的体积也无特定要求。
[0011]在一种具体实施方式中，步骤(2)所述内套管下部填充脱脂棉，防止离心时胶块一同被离心到下管中。步骤(2)得到的离心液为含有ssDNA的核酸电泳液(TAE)。
[0012]在一种具体实施方式中，步骤(2)所述离心转速可以为10000rpm、11000rmp、12000rpm、13000rmp、14000rpm；优选12000rmp
‑
13000rmp；离心时间可以为10min、20min、30min、40min以彻底分离液体为宜。
[0013]在一种具体实施方式中，步骤(3)中，所述氨基修饰的磁性粒子选自氨基修饰的硅包磁性粒子，氨基修饰的聚苯乙烯磁性粒子，或其他带有氨基的磁性粒子。甚至可以是其他非磁性的氨基修饰的粒子，只要通过离心可以将其沉淀即可。所述氨基修饰的磁性离子可以商购，例如美国Bangs Laboratories公司的BP617；也可以按照本领域已知的方法自行合成。
[0014]在一种具体实施方式中，步骤(3)中，吸附完成后，用核酸电泳缓冲液(TAE)洗涤磁性粒子一次，弃去溶液部分。
[0015]在一种具体实施方式中，步骤(3)中，所述氨基修饰的磁性粒子的用量可以为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、120μg、150μg、180μg、200μg。
[0016]在一种具体实施方式中，步骤(3)中，所述反应温度为70
‑
90℃。例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃以及中间的任意值。
[0017]在一种具体实施方式中，为更高效的得到ssDNA片段，在步骤(4)中，所述含有磷酸根的溶液选自dNTP溶液或者PBS缓冲液。优选地，所述dNTP溶液浓度为1
‑
20mM；所述PBS的浓度为50mM
‑
100mM，pH为6.8
‑
7.4。
[0018]在一种具体实施方式中，在步骤(4)中，所述1
‑
20mM dNTP溶液加入到磁性复合物中，60
‑
100℃下混合10
‑
30min；磁性分离，吸取上清液即为目标ssDNA。
[0019]在一种具体实施方式中，在步骤(4)中，所述50
‑
100mM磷酸盐缓冲液为pH 6.8
‑
7.4，优选pH 7.2。实际操作可在60
‑
100℃下混合10
‑
30min；磁性分离，吸取上清液即为目标ssDNA。
[0020]所述dNTP浓度可以为1mM、5nM、10nM、15nM、20mM。
[0021]在一种具体实施方式中，步骤(4)中，dNTP或PBS取代ssDNA与氨基磁性粒子结合的磷酸根，从而释放ssDNA。本专利技术所述dNTP或PBS根据需求可以进行调整，可用其他带有磷酸基团的物质取代。氨基化磁性纳米粒子对于单链有较好的吸附能力，通过加入磷酸根就可以将其从氨基磁性纳米粒子表面洗脱。本专利技术所得到的ssDNA中，混有少量dNTP或者磷酸盐，但是根据需求并不影响其后的应用。
[0022]在一种具体实施方式中，步骤(2)
‑
步骤(4)中，为避免操作的污染和对ssDNA回收的影响，所用材料与试剂均灭菌处理；优选地，所述操作在无菌环境中进行。
[0023]为更有利于理解本专利技术的技术方案，在一种具体实施方式中，本专利技术的一种简便高效的短片段ssDNA琼脂糖凝胶回收方法，该方法包括以下步骤：
[0024](1)切胶ssDNA上样于琼脂糖凝胶电泳，将含有目的ssDNA条带的胶块从琼脂糖凝胶中切下。切胶时注意不切到其他条带即可，对胶块形状或者大小无具体要求。因为是短片段ssDNA，较为容易通过离心甩出。此外，因为是磁性吸附，所以对甩出液的体积也无特定要求。
[0025](2)离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种简便高效的短片段ssDNA琼脂糖凝胶回收方法，包括以下步骤：(1)切胶：ssDNA上样于琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖凝胶上对应的ssDNA条带切块；(2)离心：将步骤(1)得到的胶块加入带有内套管的纯化柱中，10000
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14000rpm离心10
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40min，收集管底离心液；(3)磁性吸附：将10
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200μg的氨基修饰的磁性粒子加入到离心液中，60
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100℃下混合10
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30min；(4)解吸附：将含有磷酸根的溶液加入到磁性复合物中，60
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100℃下混合10
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30min；磁性分离，吸取上清液即为目标ssDNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssDNA的长度为10
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120nt，优选为20
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100nt。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氨基修饰的磁性粒子选自氨基修饰的硅...

【专利技术属性】
技术研发人员：白亚龙，普春敏，廖小艳，索玉娟，邵毅，瞿洋，冯博，黄柳娟，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：