【技术实现步骤摘要】
Tris
‑
HCl，pH8.0、25mM乙二胺四乙酸二钠，pH8.0、350mM山梨糖醇、0.1％十六烷基三甲基溴化铵组成。
[0011]进一步地，所述的酚/氯仿/异戊醇的体积比为25：24：1。
[0012]进一步地，所述的氯仿/异戊醇的体积比为24：1。
[0013]进一步地，所述的乙醇为70％的乙醇。
[0014]植物超长基因组DNA的提取方法，具体步骤包括：
[0015]1)使用1
‑
2g小麦的幼嫩叶片或者小麦胚芽鞘材料，在研钵中用液氮研磨至粉末状，转移粉末到含有20
‑
40mL预冷的细胞核提取液中，并加入0.1％
‑
0.2％的β
‑
巯基乙醇，轻柔上下颠倒混匀，置于冰上；在冰上静置10min以上，待植物组织粉末完全溶解混匀后，分别采用Miracloth滤布、40μm滤膜、30μm滤膜过滤一次；过滤后的提取液于4℃下，50
‑
60rcf离心3
‑
5min两次去除杂质，取上清，后1000
‑
2500rcf离心5min，弃上清得到细胞核沉淀；用10mL细胞核提取液重悬细胞核沉淀，清洗2次，弃上清。
[0016]2)用5mL细胞核重悬缓冲液重悬洗涤后的细胞核沉淀，清洗一次，再次加入1
‑
2ml细胞核重悬缓冲液；加入等体积的2
×
SDS裂解液，同时在裂解液中加入0.05
‑
1mg/mL的蛋白酶K和1
‑>100ug/mL的RNase A；颠倒混匀后，于50℃金属浴或水浴锅中裂解0.5
‑
2.5h。
[0017]3)裂解完成后，待裂解液冷却至室温，加入3mL的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提，10rpm混匀10min，4000g离心10min，用宽口枪头取上清加入到新的离心管；上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇抽提1次；再加入等体积的氯仿，抽提1次，取上清加入新的离心管中；加入0.7
×
体积的异丙醇溶液，轻轻混匀直到絮状沉淀析出；用移液器将絮状沉淀转移到1.5mL离心管中，用70％乙醇清洗两次，晾干30s，加水或TE缓冲液过夜溶解DNA。
[0018]本专利技术的植物超长基因组DNA的提取方法获得的大于400Kb的高质量DNA。
[0019]本专利技术的植物超长基因组DNA的提取方法获得的N50大于120Kb的高质量DNA。
[0020]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0021]1)本专利技术细胞核提取采用三次过滤的方法，可去除大部分植物碎片组织杂质，获得较纯净的细胞核，减少了提取后DNA中的杂质。
[0022]2)本专利技术获得的DNA长度有明显优势，无需进一步纯化去除小片段，就可获得长度大于485Kb的片段。
[0023]3)本专利技术的方法提取的DNA，无需经过HLS等仪器的纯化，可直接进行超长文库构建测序，N50高达125.25Kb，最长测序reads可达4.98Mb。
[0024]4)本专利技术的方法提取的小麦DNA、辣椒DNA、南瓜DNA、西瓜DNA以及番茄DNA都可获得大于400Kb的高质量DNA，其中小麦和辣椒的测序获得的N50均可达120Kb。
附图说明
[0025]图1为本专利技术方法提取小麦基因组电泳图；
[0026]图2为本专利技术方法提取辣椒基因组电泳图；
[0027]图3为本专利技术方法提取南瓜基因组电泳图；
[0028]图4为本专利技术方法提取西瓜基因组电泳图；
[0029]图5为本专利技术方法提取番茄基因组电泳图；
[0030]图6为CTAB法提取小麦基因组电泳图；
[0031]图7为NEB试剂盒法提取番茄基因组电泳图。
具体实施方式
[0032]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033]细胞核提取液的组成成分：0.5M蔗糖、10mM pH8.0Tris
‑
HCl、10mM pH 8.0乙二胺四乙酸二钠、80mM氯化钾、1％聚乙烯吡咯烷酮、350mM山梨糖醇、0.5％Triton X
‑
100、1mM精胺、1mM亚精胺、0.1％
‑
0.2％巯基乙醇，在使用前加入。
[0034]细胞核重悬缓冲液的组成成分：150mM氯化钠、100mM pH8.0Tris
‑
HCl、25mM pH 8.0乙二胺四乙酸二钠、350mM山梨糖醇。
[0035]2×
SDS裂解液的组成成分：20g/L十二烷基磺酸钠、150mM氯化钠、100mM pH8.0Tris
‑
HCl、25mM pH 8.0乙二胺四乙酸二钠、350mM山梨糖醇、0.1％十六烷基三甲基溴化铵。
[0036]CTAB法使用CTAB裂解液组成成分：100mM pH8.0Tris
‑
HCl、20mM pH 8.0乙二胺四乙酸二钠、1.50M氯化钠、3％十六烷基三甲基溴化铵、1％聚乙二醇6000、0.5％亚硫酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮。
[0037]实施例1
[0038]1、细胞核提取和分离
[0039]使用1
‑
2g小麦的幼嫩叶片或者小麦胚芽鞘材料，在研钵中用液氮研磨至粉末状，转移粉末到含有20
‑
40mL预冷的细胞核提取液中，并加入0.1％
‑
0.2％的β
‑
巯基乙醇，轻柔上下颠倒混匀，置于冰上；在冰上静置10min以上，待植物组织粉末完全溶解混匀后，分别采用Miracloth滤布、40μm滤膜、30μm滤膜过滤一次；过滤后的提取液于4℃下，50
‑
60rcf离心3
‑
5min两次去除杂质，取上清，后在1000
‑
2500rcf离心5min，弃上清得到细胞核沉淀；用10mL细胞核提取液重悬细胞核沉淀，清洗2次，弃上清。
[0040]2、细胞核裂解
[0041]用1
‑
2mL细胞核重悬缓冲液重悬洗涤后的细胞核沉淀；加入等体积的2
×
SDS裂解液，同时在裂解液中加入40ul 20mg/mL的蛋白酶K和20ul 10mg/ml的RNase A；颠倒混匀后，于50℃金属浴或水浴锅中裂解1.5h。
[0042]3、DNA抽提
[0043]裂解完成后，待裂解液冷却至室温，加入3mL的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)溶液抽提，10rpm混匀10min，4000g离心10min，用宽口枪头取上清加入到新的离心管；上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提1次；再加入等体积的氯仿，抽提1次，取上清加入新的离心管中；加入0.7
×
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，将植物幼嫩的组织研磨成粉末后加入到细胞核提取液中，通过过滤和离心得到细胞核沉淀；用细胞核重悬缓冲液重悬细胞核，然后加入SDS裂解液；后用酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇和氯仿抽提，取上清加入异丙醇获取DNA沉淀，用乙醇清洗后晾干。2.根据权利要求1所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的细胞核提取液由0.5M蔗糖、10mM Tris
‑
HCl，pH8.0、10mM乙二胺四乙酸二钠，pH 8.0、80mM氯化钾、1％聚乙烯吡咯烷酮、350mM山梨糖醇、0.5％Triton X
‑
100、1mM精胺、1mM亚精胺、0.1％
‑
0.2％巯基乙醇组成。3.根据权利要求1所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的细胞核重悬缓冲液由150mM氯化钠、100mM Tris
‑
HCl，pH8.0、25mM乙二胺四乙酸二钠，pH8.0、350mM山梨糖醇组成。4.根据权利要求1所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的SDS裂解液由20g/L十二烷基磺酸钠、150mM氯化钠、100mM Tris
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HCl，pH8.0、25mM乙二胺四乙酸二钠，pH8.0、350mM山梨糖醇、0.1％十六烷基三甲基溴化铵组成。5.根据权利要求1所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的酚/氯仿/异戊醇的体积比为25∶24∶1。6.根据权利要求1所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的氯仿/异戊醇的体积比为24∶1。7.根据权利要求1所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的乙醇为70％的乙醇。8.根据权利要求1
‑
7任一所述的植物超长基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体步骤包括：1)使用1
...
【专利技术属性】
技术研发人员：鹿东东，李博生，李珊珊，刘彩娟，刘艳霞，
申请(专利权)人：北京大学现代农业研究院，
类型：发明
国别省市：
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