针对自身抗体具有提高的逃逸率或活性的ADAMTS13变体制造技术

本发明专利技术涉及针对自身抗体具有提高的逃逸率的ADAMTS13突变体蛋白，和将其用于预防或治疗血栓性疾病的组合物。通过有效地避免已知对ADAMTS13的主结构域具有高结合亲和力的代表性自身抗体，本发明专利技术的ADAMTS13变体蛋白可用作有效治疗组合物，用于多种以存在这些自身抗体为主要病因的血栓性疾病例如TTP(血栓性血小板减少性紫癜)等，并且当施用到体内时可稳定地保持其生物活性。另外，由于在ADAMTS13内鉴定了自身抗体所识别的新位点，因此本发明专利技术可通过在相应位点内应用多个突变的组合来有效地用于筛选具有提高的自身抗体逃逸率的新ADAMTS13变体。ADAMTS13变体。ADAMTS13变体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对自身抗体具有提高的逃逸率或活性的ADAMTS13变体


[0001]本专利技术涉及针对自身抗体具有降低的或高的酶活性的ADAMTS13变体和将其用于治疗血栓性疾病的组合物。

技术介绍

[0002]血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)是属于血栓性微血管病的罕见血液疾病，该病在全身的小血管中形成血凝块，如不立即治疗可导致死亡。已知发病率为每年每100万人中1.5至6例，并且主要在平均年龄为40岁的成年人以及妇女中具有高发病率(Miesbach et al.,2019)。其病理学特征包括血小板减少、红细胞减少、血细胞比容(hematocrit，HCT)增加等，并且由于血凝块，已知在许多器官例如肾、心脏、脑中发生功能障碍。其症状包括瘀伤、发热、乏力、呼吸困难、意识模糊、头痛等(Hovinga et al.,2017)。
[0003]血栓性血小板减少性紫癜(TTP)分为两类：先天性TTP(congenital TTP，cTTP)，其由于编码ADAMTS13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1motif,member 13)(具有血小板应答蛋白1型基序的去整合素和金属蛋白酶，成员13)的基因的功能障碍导致先天性ADAMTS13功能缺陷；和获得性TTP(acquired TTP，aTTP)，其是由于获得性原因导致的ADAMTS13活性降低引起的。一般而言，当ADAMTS13活性低于正常TTP的10％时，诊断为TTP。据报道，aTTP是由细菌感染、某些药物、自身免疫病(例如狼疮)、妊娠等引起的，并且作为发病机制的主要机制之一，已报道了由于自身抗体识别ADAMTS13而抑制ADAMTS13活性(GARD program,2018)。ADAMTS13酶在以下方面发挥作用：将冯
·
维勒布兰德因子(von Willebrand factor，vWF)的大的多聚体分解为较小单位，其中在aTTP患者中发现的抗体与ADAMTS13结合并抑制其功能，并阻止vWF降解，并且最终导致血凝块和血小板过度产生，从而导致疾病。
[0004]作为对cTTP患者的标准治疗，使用通过注射新鲜冷冻血浆(fresh frozen plasma)来提供缺乏的分解酶的补充治疗，而对于aTTP患者，为了缓解症状，通过进行血浆置换(plasma exchange，PEX)来去除中和抗体。在aTTP患者的情况下，组合施用免疫抑制剂(泼尼松龙(prednisolone)、皮质类固醇(corticosteroid)等)以提高治疗作用、防止复发，并且利妥昔单抗(rituximab)(其诱导B细胞死亡)可用于减少中和抗体的产生。虽然血浆置换的次数取决于疾病的严重程度和症状的进展，但通常需要数次血浆置换以使血小板计数正常化。目前的治疗具有局限性，例如重复血浆置换的不便以及使用免疫抑制剂导致对感染的易感性提高。
[0005]因此，为了克服针对TTP的常规治疗的局限性，本专利技术人制备了重组ADAMTS13蛋白变体，其通过有效地逃逸与患者自身抗体的结合即使在存在自身抗体的情况下也能够而保持活性，并且通过在TTP小鼠模型中的效力评价确认了重组ADAMTS13蛋白变体可有效地用作针对TTP的有效治疗。
[0006]在整个说明书中引用了许多期刊文章和专利文件，并指出了其引用。引用的期刊
文章和专利文件的公开内容通过引用其整体并入本文以更清楚地描述本专利技术所属
的水平和本专利技术的细节。
[0007]专利技术的公开内容
[0008]技术问题
[0009]本专利技术人已进行了广泛的努力以开发用于治疗多种ADAMTS13功能障碍性疾病的有效且基本的方法，所述疾病大部分属于难治性罕见疾病。作为结果，本专利技术人已发现当鉴定出由自身抗体识别的ADAMTS13的核心区域并且将这些区域中的一些氨基酸替换时，阻断了与自身抗体的结合，并保持了针对vWF降解和血栓形成抑制的活性，并且因此可用作有效治疗组合物，用于由过度血栓形成引起的多种疾病(包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP))，从而完成本专利技术。
[0010]因此，本专利技术的一个目的是提供ADAMTS13变体蛋白或其功能片段。
[0011]本专利技术的另一个目的是提供用于预防或治疗血栓性疾病的组合物。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供用于筛选针对ADAMTS13自身抗体具有提高的逃逸率的ADAMTS13变体蛋白的方法。
[0013]本专利技术的其他目的和优点将从以下本专利技术的详细描述、权利要求书和附图中变得更加明显。
[0014]问题的解决方案
[0015]根据本专利技术的一个方面，提供了ADAMTS13(具有血小板应答蛋白1型基序的去整合素和金属蛋白酶，成员13)变体蛋白或其功能片段，其包含选自以下的一个或更多个氨基酸残基的替换：SEQ ID NO:1的第85位残基、第93位残基、第126位残基、第135位残基、第278位残基、第282位残基、第308位残基、第314位残基、第317位残基、第334位残基、第364位残基、第376位残基、第413位残基、第427位残基、第452位残基、第465位残基、第567位残基、第578位残基、第585位残基、第589位残基、第607位残基、第608位残基、第609位残基、第612位残基、第618位残基、第624位残基、第630位残基、第635位残基、第643位残基、第650位残基、第651位残基、第654位残基、第655位残基、第656位残基、第658位残基、第664位残基和第672位残基。
[0016]本专利技术人已进行了广泛的努力以开发用于治疗多种ADAMTS13功能障碍性疾病的有效且基本的方法，所述疾病大部分属于难治性罕见疾病。作为结果，本专利技术人已发现当鉴定出由自身抗体识别的ADAMTS13的核心区域并且将这些区域中的一些氨基酸替换时，阻断了与自身抗体的结合，并且保持了vWF降解和血栓形成抑制的活性，并且因此可用作有效治疗组合物，用于由过度血栓形成引起的多种疾病(包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP))。
[0017]本文中使用的术语“蛋白质”是指通过肽键使氨基酸残基相互结合而形成的线性分子。
[0018]本文中使用的术语“功能片段”是指全长蛋白质的类似物，其是全长蛋白质的其中一些氨基酸残基已缺失、保持全长蛋白质原始生物活性和功能的片段。
[0019]根据本专利技术，SEQ ID NO:1是由1427个氨基酸组成的ADAMTS13蛋白的氨基酸序列。因此，本专利技术的ADAMTS13变体蛋白或其功能片段可以是全长(1427a.a.)ADAMTS13蛋白或其中将上述列出的变异引入到其功能片段(包含第75位至第685位区域)中的ADAMTS13变体。包含第75位至第685位区域的一些片段可以是，例如，1至685(685a.a.)或75至685
(611a.a.)。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.ADAMTS13(具有血小板应答蛋白1型基序的去整合素和金属蛋白酶，成员13)变体蛋白或其功能片段，其包含选自以下的一个或更多个氨基酸残基的替换：SEQ ID NO:1的第85位残基、第93位残基、第126位残基、第135位残基、第278位残基、第282位残基、第308位残基、第314位残基、第317位残基、第334位残基、第364位残基、第376位残基、第413位残基、第427位残基、第452位残基、第465位残基、第567位残基、第578位残基、第585位残基、第589位残基、第607位残基、第608位残基、第609位残基、第612位残基、第618位残基、第624位残基、第630位残基、第635位残基、第643位残基、第650位残基、第651位残基、第654位残基、第655位残基、第656位残基、第658位残基、第664位残基和第672位残基。2.权利要求1所述的ADAMTS13变体蛋白或其功能片段，其中所述ADAMTS13变体蛋白选自包含在以下位置的氨基酸残基替换的每种变体蛋白：
‑
第85位残基和第317位残基；第612位残基；第282位残基、第465位残基和第672位残基中的两个或更多个；第635位残基；第452位残基和第612位残基；第278位残基、第334位残基和第427位残基中的两个或更多个；第618位残基；第135位残基；第126位残基、第567位残基和第651位残基中的两个或更多个；第413位残基；第334位残基；第314位残基；第93位残基、第364位残基和第376位残基中的两个或更多个；第308位残基；第656位残基；第607位残基；第612位残基和第624位残基；第589位残基；第650位残基和第656位残基；第643位残基；第585位残基和第658位残基；第630位残基、第654位残基和第664位残基中的两个或更多个；第589位残基、第608位残基、第609位残基、第624位残基和第655位残基中的四个或更多个；第578位残基；第585位残基；第314位残基和第635位残基；以及第314位残基和第612位残基。3.权利要求1所述的ADAMTS13变体蛋白或其功能片段，其中分别地：第85位残基被替换为Phe，第93位残基被替换为Val，第126位残基被替换为Met，第135位残基被替换为Ile，第278位残基被替换为Ile，第282位残基被替换为Ala，第308位残基被替换为Lys，第314位残基被替换为Thr，第317位残基被替换为His，第334位残基被替换为Thr或Val，第364位残基被替换为Arg，第376位残基被替换为Asp，第413位残基被替换为Asp，第427位残基被替换为Asn，第452位残基被替换为Ile，第465位残基被替换为Asp，第567位残基被替换为Ser，第578位残基被替换为Leu，第585位残基被替换为Asn或Met，第589位残基被替换为Gln，第607位残基被替换为Arg，第608位残基被替换为Met，第609位残基被替换为Leu，第612位残基被替换为Phe或Tyr，第618位残基被替换为Ser，第624位残基被替换为Asp或Cys，第630位残基被替换为Leu，第635位残基被替换为Val，第643位残基被替换为Phe，第650位残基被替换为His，第651位残基被替换为Asp，第654位残基被替换为Gly，第655位残基被替换为Val，第656位残基被替...

【专利技术属性】
技术研发人员：南铉子，黄成虎，郭曦天，崔嘉熙，金洙镕，金侑映，李镕愍，李砦牧，慎善惠，权瑛银，曹胜贤，
申请(专利权)人：株式会社绿十字，
类型：发明
国别省市：