一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，涉及类胚胎构建技术领域；为了解决目前合成胚胎构建时存在的限制问题；具体包括如下步骤：建立hTSCs和hBLCs；确定hTSCs和hBLCs的hESCs状态；评估在共培养过程中，hTSCs和hBLCs的hESCs细胞能否维持自身特异性基因的持续表达；对着床后类胚胎进行构建和表征评估；优化着床后类胚胎自组装效率；对着床类细胞进行系统性评价和分析；所述对着床类细胞进行系统性评价和分析的方法，包括以下内容：系统性评价着床后类胚胎关键形态发生行为的特异性标志蛋白表达情况。本发明专利技术能够体外构建人源着床后类胚胎模型，并探索干细胞自组装机制。装机制。装机制。

【技术实现步骤摘要】
一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法


[0001]本专利技术涉及类胚胎构建
，尤其涉及一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法。

技术介绍

[0002]早期哺乳动物胚胎主要由三种不同的组织自组装而来，滋养外胚层(TE，Trophectoderm)来源的胎盘组织、外胚层(EPI，Epiblast)来源的胚胎组织，以及原始内胚层(PE，Primitiveendoderm)或人下胚层(HYPO，Hypoblast)来源的卵黄囊组织，胚胎组织与两种胚外组织的相互协调、正确组装是胚胎结构完整、功能完善、发育正常的重要前提条件，自组装过程一旦出现异常，胚胎会停止发育或导致先天缺陷。
[0003]现有技术中，利用合成胚胎学构建的人类早期胚胎在于利用干细胞自组装特性(无需精子和卵子)，在体外重现早期胚胎发育结构和功能，但存在以下限制：1)大多数人的类胚胎构建是基于单一性的人多能干细胞(hPSC)或胚胎干细胞(ESC)，和正常胚胎有所区别，不能很好地模拟早期胚胎发育关键事件，也缺乏胚胎外组织，同时在三维胚胎形态方面也有所限制；2)从人类胚胎干细胞(hESCs)中产生的类囊胚结构，很难发育到着床后阶段，限制了我们研究着床后关键发育过程。因此，在体外构建一个基于多谱系干细胞自组装的、包含胚胎细胞和胚胎外细胞的、不依赖外源性信号因子诱导的人源着床后三维类胚胎模型，对于打开早期着床后胚胎发育黑匣子、认识人类生命发生、理解早期发育调控途径和器官生成等重大基础科学问题，以及探索先天性发育疾病发生发展机制和药物筛选等领域方面有很大的价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，包括如下步骤：
[0007]S1：建立hTSCs和hBLCs；
[0008]S2：确定hTSCs和hBLCs的hESCs状态；
[0009]S3：评估在共培养过程中，hTSCs和hBLCs的hESCs细胞能否维持自身特异性基因的持续表达；
[0010]S4：对着床后类胚胎进行构建和表征评估；
[0011]S5：优化着床后类胚胎自组装效率；
[0012]S6：对着床类细胞进行系统性评价和分析；
[0013]所述对着床类细胞进行系统性评价和分析的方法，包括以下内容：
[0014]S111：系统性评价着床后类胚胎关键形态发生行为的特异性标志蛋白表达情况，操作方式为：利用免疫荧光染色在不同的时间点对自组装后的所有结构进行关键形态发生
行为的特异性标志基因和蛋白的表达情况做系统性检测；
[0015]S112：对着床后类胚胎进行单细胞转录组分析。
[0016]优选地：所述hTSCs和hBLCs的建立方法，具体包括以下内容：
[0017]A1：利用Gateway克隆法构建基于PiggyBac和Tet
‑
On可诱导表达特异性转录因子的质粒；
[0018]A2：在hESCs中通过单独或联合诱导表达GATA6/SOX17构建hBLCs，通过表达GATA3/TFAP2C构建hTSCs；
[0019]所述A2之后，还包括在hIVC1培养基中添加1μg/mL强力霉素Dox，利用免疫荧光染色和qRT
‑
PCR法在不同时间点对诱导表达的hTSCs和hBLCs细胞进行表征和评估。
[0020]优选地：所述hTSCs和hBLCs的hESCs状态确定方法，包括以下内容：
[0021]B1：利用PXGL、RSeT和mTeSR1体外培养hESCs，依次模拟胚胎发育过程中着床前、着床中和着床后的EPI状态；
[0022]B2：在PXGL、RSeT和mTeSR1三种hESCs中诱导表达hBLCs和hTSCs特异性转录因子，利用免疫荧光染色和qRT
‑
PCR法对诱导表达的细胞进行表征。
[0023]优选地：所述维持自身特异性基因的持续表达的评估方法，具体包括以下内容：
[0024]C1：在hIVC1培养基中共同培养hESCs、可诱导表达的hBLCs和hTSCs；
[0025]C2：在共培养时添加1μg/mLDox诱导hBLCs和hTSCs的形成，利用免疫荧光染色和qRT
‑
PCR法对共同培养的细胞进行特异性转录因子表征。
[0026]优选地：所述着床后类胚胎的构建方法，包括以下内容：
[0027]D1：将利用RSeT培养的hESCs和诱导后的hBLCs、hTSCs用TrypLE酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；
[0028]D2：将hESCs、hBLCs和hTSCs三种细胞混合接种于抗粘附溶液处理过的含hIVC1培养基的AggreWell培养板中，离心使其均匀分布后培养；
[0029]D3：在培养过程中添加1μg/mLDOX，持续诱导特异性转录因子表达。
[0030]优选地：所述着床后类胚胎的表征评估方法，包括以下内容：
[0031]D11：在不同时间点对自组装后的结构进行4％多聚甲醛固定并免疫荧光染色；
[0032]D12：通过特异性标志蛋白染色结果结合高通量荧光图像拼接扫描法，判断各谱系细胞组装后的空间位置；
[0033]D13：对自组装后的结构进行分类，从而评估自组装后结构和天然胚胎的异同；
[0034]所述特异性标志蛋白为SOX2、GATA3和GATA6；
[0035]所述自组装后结构的培养方式，包括以下内容：
[0036]D101：在自组装第一天在培养基中添加10μMY
‑
27632；
[0037]D102：在自组装三天后，将hIVC1基础培养基替换为hIVC2培养基后继续培养，随后每天替换一半hIVC2培养基。
[0038]优选地：所述自组装效率的优化操作，具体包括以下步骤：
[0039]E1：按照不同数量将hESCs、hBLCs和hTSCs三种细胞进行混合后培养；
[0040]E2：在不同时间点对不同数量细胞的类胚胎进行免疫荧光染色，评估最佳的自组装起始条件；
[0041]E3：通过高通量荧光图像拼接扫描法定量自组装后类胚胎形成效率。
[0042]优选地：所述系统性检测的方式，具体为以下内容：
[0043]F1：在自组装后的第2～3天，通过染色SOX2/OCT4/NANOG、GATA3/CDX2/TFAP2C和GATA6/GATA4/SOX1确定hESCs、hBLCs和hTSCs细胞在三维结构中的形态分布情况和细胞不对称分化情况，通过F
‑
ACTIN/PODXL染色确定空腔形成情况，通过LAMININ或COLLAGEN判断基底膜分泌情况；
[0044]F2：在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：建立hTSCs和hBLCs；S2：确定hTSCs和hBLCs的hESCs状态；S3：评估在共培养过程中，hTSCs和hBLCs的hESCs细胞能否维持自身特异性基因的持续表达；S4：对着床后类胚胎进行构建和表征评估；S5：优化着床后类胚胎自组装效率；S6：对着床类细胞进行系统性评价和分析；所述对着床类细胞进行系统性评价和分析的方法，包括以下内容：S111：系统性评价着床后类胚胎关键形态发生行为的特异性标志蛋白表达情况，操作方式为：利用免疫荧光染色在不同的时间点对自组装后的所有结构进行关键形态发生行为的特异性标志基因和蛋白的表达情况做系统性检测；S112：对着床后类胚胎进行单细胞转录组分析。2.根据权利要求1所述的一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，其特征在于，所述hTSCs和hBLCs的建立方法，具体包括以下内容：A1：利用Gateway克隆法构建基于PiggyBac和Tet
‑
On可诱导表达特异性转录因子的质粒；A2：在hESCs中通过单独或联合诱导表达GATA6/SOX17构建hBLCs，通过表达GATA3/TFAP2C构建hTSCs；所述A2之后，还包括在hIVC1培养基中添加1μg/mL强力霉素Dox，利用免疫荧光染色和qRT
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PCR法在不同时间点对诱导表达的hTSCs和hBLCs细胞进行表征和评估。3.根据权利要求2所述的一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，其特征在于，所述hTSCs和hBLCs的hESCs状态确定方法，包括以下内容：B1：利用PXGL、RSeT和mTeSR1体外培养hESCs，依次模拟胚胎发育过程中着床前、着床中和着床后的EPI状态；B2：在PXGL、RSeT和mTeSR1三种hESCs中诱导表达hBLCs和hTSCs特异性转录因子，利用免疫荧光染色和qRT
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PCR法对诱导表达的细胞进行表征。4.根据权利要求3所述的一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，其特征在于，所述维持自身特异性基因的持续表达的评估方法，具体包括以下内容：C1：在hIVC1培养基中共同培养hESCs、可诱导表达的hBLCs和hTSCs；C2：在共培养时添加1μg/mLDox诱导hBLCs和hTSCs的形成，利用免疫荧光染色和qRT
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PCR法对共同培养的细胞进行特异性转录因子表征。5.根据权利要求1所述的一种基于人源胚胎干细胞自组装的类胚胎构建方法，其特征在于，所述着床后类胚胎的构建方法，包括以下内容：D1：将利用RSeT培养的hESCs和诱导后的hBLCs、hTSCs用TrypLE酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；D2：将hESCs、hBLCs和hTSCs三种细胞混合接种于抗粘附溶液处理过的含hIVC1培养基的AggreWell培养板中，离心使其均匀分布后培养；D3：在培养过程中添...

【专利技术属性】
技术研发人员：包敏，宋伟宏，
申请(专利权)人：瓯江实验室，
类型：发明
国别省市：