一种利用家蚕生产甜菜红色素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用家蚕生产甜菜红色素的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术公开的方法通过在家蚕丝腺中特异表达三个甜菜红色素合成基因，实现了甜菜红色素的大量异源表达，产量达到14.4μg/mg蚕茧，为甜菜红色素的生产提供了新途径；蚕茧中的甜菜红色素可用水提取，方法简便且不存在残留的问题，并且经过甜菜红色素提取后，蚕丝的丝质未发生明显变化，不影响蚕茧原有的经济价值；本发明专利技术可以使甜菜红色素成为蚕业生产的副产品，极大地提高经济效益。效益。效益。

【技术实现步骤摘要】
一种利用家蚕生产甜菜红色素的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种利用家蚕生产甜菜红色素的方法。

技术介绍

[0002]甜菜红色素是一类水溶性的天然色素，存在于石竹目的植物和极少数的微生物中。甜菜红色素包括紫红色的甜菜红素和黄色的甜菜黄素两类，以酪氨酸为底物，通过三个酶促反应和若干个自发反应合成。首先，在细胞色素P450酶(CYP76AD1/5/6)的催化作用下，酪氨酸羟基化为L
‑
3,4
‑
二羟基苯丙氨酸(左旋多巴，L
‑
DOPA)。随后，L
‑
DOPA被CYP76AD1进一步氧化并环化为cyclo
‑
DOPA。另外，L
‑
DOPA也可以在DOPA 4,5
‑
双加氧酶(DODA)的作用下转化为甜菜醛氨酸(betalamic acid)。随后cyclo
‑
DOPA和甜菜醛氨酸经过自发反应生成甜菜苷配基(betanidin)。最后，甜菜苷配基在5
‑
O
‑
葡糖基转移酶(betanidin 5
‑
O
‑
glucosyltransferase)的作用下糖基化生成结构最简单的甜菜红素，甜菜苷(betanin)。此外，还有另外一条合成途径：cyclo
‑
DOPA首先在5'O位置被5
‑
O葡萄糖基转移酶(cDOPA5GT)糖基化形成cyclo
‑/>DOPA
‑5‑
O葡糖苷，其随后与甜菜醛氨酸经过自发反应生成甜菜苷。甜菜苷还可发生糖基化和乙酰化，形成更多种结构复杂的甜菜红素。此外，甜菜醛氨酸也可以与氨基酸和其他胺类物质发生自发反应生成甜菜黄素(betaxanthins)。
[0003]除了具有艳丽的颜色，甜菜红色素还具有多种潜在的有益作用，包括抗氧化、降血脂、保肝、抗炎症和抗糖尿病等。因此，甜菜红色素通常被用作优质的食品添加剂。目前，食用红甜菜是获得甜菜红色素的主要原料，需要经过多个步骤的提取和纯化。现有的提取方法步骤繁琐，并且存在残留问题。因此，亟需开发大量获取甜菜红色素的新原料和新方法。
[0004]得益于合成途径的解析，甜菜红色素的异源合成已经在多种生物中得以实现，包括植物模式生物(拟南芥和烟草)、重要作物(水稻、番茄、马铃薯、茄子和棉花)和微生物(大肠杆菌和酿酒酵母)等。但在植物和微生物中的异源合成，提取时同样面临类似的问题。目前尚未有在动物中合成甜菜红色素的相关报导。
[0005]家蚕是丝绸工业中最重要的经济昆虫，也是鳞翅目的模式生物。基于高效合成蛋白质的能力和日趋成熟的遗传转化技术，家蚕丝腺已经成为生产外源蛋白质的理想生物反应器。迄今为止，几乎所有的家蚕丝腺生物反应器都局限于单一外源蛋白的表达。通过引入外源合成通路，大量生产有价值的生物分子是进一步开发完善家蚕丝腺生物反应器的新方向。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是提供一种生产甜菜红色素的家蚕的构建方法。本专利技术的第二目的是提供一种利用家蚕生产甜菜红色素的方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种生产甜菜红色素的家蚕的构建方法，将转基因质粒导入家蚕细胞中得到，所述转基因质粒含有SEQ ID NO：5所示的基因片段。
[0009]进一步地，所述转基因质粒还包括丝素重链启动子FibH
‑
P、丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD和丝素重链C端结构域FibH
‑
CTD。
[0010]进一步地，所述丝素重链启动子FibH
‑
P的序列如SEQ ID NO：6所示；所述丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD的序列如SEQ ID NO：7所示；所述丝素重链N端结构域FibH
‑
CTD的序列如SEQ ID NO：8所示。
[0011]进一步地，具体包括以下步骤：
[0012]S1.构建甜菜红色素合成基因开放式阅读框：使用自剪切肽P2A的基因序列将编码所述细胞色素P450酶CYP76AD1的基因、编码所述DOPA 4，5
‑
双加氧酶的基因和编码所述5
‑
O
‑
葡糖基转移酶的基因序列连接，经优化后，得到SEQ ID NO：5所示的基因片段；
[0013]S2.构建转基因质粒：将家蚕的丝素重链启动子FibH
‑
P、丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD和丝素重链C端结构域FibH
‑
CTD的基因序列连接至原始转基因载体中，之后连接步骤S1构成的基因片段，并将原始转基因载体中的IE1启动子替换为3
×
P3启动子，获得转基因质粒；
[0014]S3.构建转基因家蚕：将步骤S2获得的转基因质粒、转座酶mRNA以及辅助质粒混合后注射进家蚕胚胎，经催青、孵化、饲养、化蛾，得G0代蚕蛾，之后与野生型蚕蛾杂交，阳性筛选获得的胚胎为生产甜菜红色素的家蚕。
[0015]进一步地，在步骤S1中，所述自剪切肽P2A的基因序列如SEQ ID NO：4所示。
[0016]进一步地，在步骤S2中，所述原始转基因载体为Pxl
‑
Bac
Ⅱ‑
IE1
‑
DsRed2；所述转基因质粒的连接元件自5
’
端到3
’
端依次为丝素重链启动子FibH
‑
P、丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD、SEQ ID NO：5所示的基因片段和丝素重链C端结构域FibH
‑
CTD。
[0017]进一步地，在步骤S2中，扩增3
×
P3启动子所用扩增引物为3
×
P3
‑
F和3
×
P3
‑
R，核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示；扩增FibH
‑
P和FibH
‑
NTD使用的扩增引物为FibH
‑
P
‑
F和FibH
‑
P
‑
NTD
‑
R，核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示；扩增FibH
‑
CTD所用扩增引物为FibH
‑
CTD
‑
F和FibH
‑
CTD
‑
R，核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。
[0018]进一步地，在步骤S3中，所述辅助质粒包括PHA3PIG；所述转基因质粒、转座酶mRNA以及辅助质粒的混合质量比为2：1：2。
[0019]本专利技术还提供一种生产甜菜红色素的方法，所述方法为收集上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产甜菜红色素的家蚕的构建方法，其特征在于，将转基因质粒导入家蚕细胞中得到，所述转基因质粒含有SEQ ID NO：5所示的基因片段。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述转基因质粒还包括丝素重链启动子FibH
‑
P、丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD和丝素重链C端结构域FibH
‑
CTD。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述丝素重链启动子FibH
‑
P的序列如SEQ ID NO：6所示；所述丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD的序列如SEQ ID NO：7所示；所述丝素重链N端结构域FibH
‑
CTD的序列如SEQ ID NO：8所示。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1.构建甜菜红色素合成基因开放式阅读框：使用自剪切肽P2A的基因序列将编码所述细胞色素P450酶CYP76AD1的基因、编码所述DOPA4，5
‑
双加氧酶的基因和编码所述5
‑
O
‑
葡糖基转移酶的基因序列连接，经优化后，得到SEQ ID NO：5所示的基因片段；S2.构建转基因质粒：将家蚕的丝素重链启动子FibH
‑
P、丝素重链N端结构域FibH
‑
NTD和丝素重链C端结构域FibH
‑
CTD的基因序列连接至原始转基因载体中，之后连接步骤S1构成的基因片段，并将原始转基因载体中的IE1启动子替换为3
×
P3启动子，获得转基因质粒；S3.构建转基因家蚕：将步骤S2获得的转基因质粒、转座酶mRNA以及辅助质粒混合后注射进家蚕胚胎，经催青、孵化、饲养、化蛾，得G0代蚕蛾，之后与野生型蚕蛾杂交，阳性筛选获得的胚胎为生产甜菜红色素的家蚕。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，所述自剪切肽P2A的基因序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭安江，陈凯，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：