一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法，包括以下步骤：(1)菌种活化：挑取保藏于

【技术实现步骤摘要】
一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法


[0001]本专利技术涉及提高HEK293悬浮细胞瞬时转染
，具体为一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法。

技术介绍

[0002]自20世纪70年代人胚肾细胞被建立以来，由于转染效率高，生长快速且表达的蛋白与天然人源蛋白高度相似，使得HEK293细胞被广泛用于重组蛋白、病毒样颗粒和病毒载体的生产。广泛用于疫苗、基因治疗，蛋白治疗药物，诊断及科研领域。HEK293细胞瞬时表达重组蛋白的表达量通常在毫克至克级水平，差异非常大，因此深入研究影响HEK293瞬时表达的关键因素非常重要。
[0003]悬浮培养的细胞可以保存在未经组织培养处理的培养瓶中，但随着培养体积与表面积的增加，充分的气体交换会受到阻碍，培养基需要搅拌。这种搅拌通常通过磁力搅拌器或振荡的锥形瓶瓶来实现。不需要酶解或机械解离，更容易传代，也更容易实现大规模培养。
[0004]细胞转染方法可大致分为生物方法、化学方法和物理方法。生物学方法利用病毒载体来实现基因转移，但存在安全问题。化学方法，如脂质体试剂PEI等，PEI在许多细胞系中具有较高的基因转移能力，同时显示低细胞毒性，具有安全、大规模生产和递送大基因片段的能力的优点。物理方法可以利用多种物理工具传递遗传物质，实现批量转染或单细胞转染，如声波穿透法、电穿孔法等。
[0005]重组蛋白被广泛用于科研、药物研发、疾病诊断和治疗，具有非常重要的商业价值。转染分为瞬时转染和稳定转染，传统的哺乳动物细胞表达体系是构建细胞稳定表达的将外源基因整合到宿主细胞染色体上的稳定株表达体系，这个过程通常需要几个月的时间并且花费大量的人力来完成。而瞬时转染的外源DNA不整合到宿主细胞DNA中，其在细胞中的数目通常随着细胞的分裂而减少，只需要几天到十几天的时间就可以拿到基因的表达产物，而且其通用性强，因此蛋白瞬时表达技术被广泛使用。
[0006]适当配方的微量金属元素，包括硒、锌、铜和钙等，在培养基中优化其其他成分有利于可扩展性，提高一致性的批次到批次的性能，提高最大活细胞密度、细胞活率，并提高瞬转效率，其中Ca2+对于细胞结团性质、细胞生长分化及产物产量都有显著影响的问题，为此，我们提出一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法，解决了现有的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种提高HEK293悬浮细胞瞬时转染效率的方法，包括以下步骤：
[0009](1)菌种活化
[0010]挑取保藏于
‑
80℃低温冰箱中的大肠杆菌菌株接种到经无菌处理的固体培养基斜面上，37℃培养过夜培养进行菌种活化；
[0011](2)大肠杆菌5α摇瓶培养
[0012]从所述斜面上挑取菌落接入液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养；
[0013](3)质粒的提取
[0014]取步骤(2)中的大肠杆菌离心，使用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的提取，提取后的质粒用测出质粒浓度和纯度。
[0015]优选的，所述步骤(1)中，固体培养基的组成为：Tryptone10g/L，YeastExtract5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，预先在121℃下高温灭菌30min。
[0016]优选的，所述步骤(1)中，液体培养基的组成为：Tryptone10g/L，YeastExtract5g/L，NaCl 10g/L，预先在121℃下高温灭菌30min。
[0017]HEK293细胞瞬时转染方法，包括以下步骤：
[0018](1)先将脂质复合物PEI与从上述提取的质粒在含有Ca
2+
的培养基里进行孵育25
‑
30min，得到PEI/DNA复合物；
[0019](2)将上述转染复合物PEI/DNA缓慢滴加到HEK293细胞中，120rpm，37℃，5％CO2的条件下悬浮培养；
[0020](3)细胞转染24h后，进行补料：5％FM01A+0.5％FM01B，保证糖的含量为8g/L，残糖含量不低于2g/L；
[0021]优选的，所述步骤(1)中孵育培养基为含有10mg/L的CaCl2的上海宥艺培养基CD01。
[0022]优选的，所述步骤(1)中转染时的细胞密度为4
×
106cells/mL。
[0023]优选的，所述步骤(1)中转染时DNA含量为1.5mg/L，PEI/DNA比例为3。
[0024]实验用到两种质粒，先以EGFP质粒作为目的质粒，再用PD
‑
1质粒作为验证。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0026]本实验使用的HEK293悬浮细胞有生长速度快、细胞活力强、易于控制、实验周期短操作简单，实验重复性好。
[0027]本专利技术提供了一种HEK293细胞瞬时表达系统转染方法，本专利技术中选择在培养基里额外添加CaCl2试剂，并在细胞转染24h后进行补料，提高了HEK293细胞外源蛋白的表达水平，使得目的基因可高效表达，节约了实验成本。
附图说明
[0028]图1：表达EGFP蛋白的电泳图；
[0029]图2A
‑
C：细胞在不同浓度Ca
2+
的培养基里瞬转培养48h后的流式细胞图结果，效率最高为67.9％；图2D：细胞在含有不同Ca
2+
的培养基里瞬转培养48h后的瞬转效率折线图；
[0030]图3A：瞬转EGFP质粒的细胞在含有不同浓度Ca
2+
的培养基里瞬转培养5天的细胞活率及密度；图3B瞬转PD1质粒的细胞在含有不同浓度Ca
2+
的培养基里瞬转培养5天的细胞活率及密度；
[0031]图4：将PD1质粒瞬转进细胞后，培养5d收获，在含有不同浓度Ca
2+
的培养基里瞬转培养产物的产量，PD1产量最高为87mg/L；序号1：培养基中含有1mg/LCaCl2；序号2：培养基
中含有2mg/LCaCl2；序号3：培养基中含有5mg/LCaCl2；序号4：培养基中含有10mg/LCaCl2；序号5：培养基中含有15mg/LCaCl2；
[0032]图5：通过qPCR(Real
‑
timeQuantitativePCR)即实时荧光定量聚合酶链式反应的方法探究不同时间在含10mg/mLCaCl2培养基与不含有CaCl2的培养基中瞬转后，EGFP的相对表达量，以不含有CaCl2培养基中瞬转2h那一组的表达量为对照组。
具体实施方式
[0033]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0034]请参阅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将质粒瞬时转入HEK293细胞中表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化挑取保藏于
‑
80℃低温冰箱中的大肠杆菌菌株接种到经无菌处理的固体培养基斜面上，37℃培养过夜培养进行菌种活化；(2)大肠杆菌5α摇瓶培养从所述斜面上挑取菌落接入液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养；(3)质粒的提取取步骤(2)中的大肠杆菌离心，使用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的提取，提取后的质粒用测出质粒浓度和纯度。2.根据权利要求1所述的一种将质粒瞬时转入HEK293细胞中表达蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，固体培养基的组成为：Tryptone10g/L，YeastExtract5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，预先在121℃下高温灭菌30min。3.根据权利要求1所述的一种将质粒瞬时转入HEK293细胞中表达蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，液体培养基的组成为：Tryptone10g/L，YeastExtract5g/L，NaCl 10g/L，预先在121℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：储炬，桂宇茜，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：