用于生产外泌体的载体、生产方法、外泌体及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于生产外泌体的载体、生产方法、外泌体及其应用，涉及生物技术领域，本发明专利技术提供的用于生产外泌体的载体，通过特定组成的药物载体和结合载体，能够实现在外泌体膜上的直接连接，相比于传统技术中插入在生产外泌体细胞中的外源基因载体，应用其可以有效地制备高表达目的蛋白的外泌体。地制备高表达目的蛋白的外泌体。

【技术实现步骤摘要】
用于生产外泌体的载体、生产方法、外泌体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于生产外泌体的载体、生产方法、外泌体及其应用。

技术介绍

[0002]作为间充质干细胞发挥血管生成和组织修复的关键原因，外泌体治疗表现出可以克服传统干细胞移植相关的副作用，表现出低免疫原性和稳定性。作为一种无细胞疗法，人脐带间充质细胞(UCMSCs)来源的外泌体(UCMSCs
‑
exo)被证明可以促进血管功能和血管新生发挥强大的组织修复功能。到目前为止，间充质干细胞来源外泌体不仅作为继承归巢能力靶向损伤部位的载体，也是具有改善血管新生和组织重塑的生物制剂。通过药物刺激，基因工程或者表面修饰等手段增强外泌体的生物功能不断被探索。
[0003]尽管可用于治疗各种人类疾病的治疗性蛋白质清单很多，但绝大多数临床可用的蛋白质药物，如细胞因子、激素和单克隆抗体，都仅限于细胞外作用机制。细胞内的蛋白质已被确定为具有生物制剂药物的潜力；然而，与细胞内蛋白质递送相关的许多挑战仍有待解决。蛋白质转导方法已经被提出来，以将重组蛋白质输送到体外和体内的目标细胞中。尽管这些技术很有前景，但蛋白质表面在溶液中的暴露和重组蛋白质在目标细胞中的低折叠率仍然是治疗性蛋白质在细胞内递送的重要障碍。一些脂质纳米粒子介导的蛋白质递送方法已经被提出来了，如发挥保护机制的蛋白质封装一样。然而，货物蛋白和脂质纳米颗粒之间缺乏分离机制，这不仅限制了细胞传递的效率，这些颗粒的制备往往涉及复杂的蛋白质纯化步骤。而近年来，通过全身注射负载siRNA或miRNA的外泌体体内输送到特定的靶组织成为一种新型策略，但基于通过电转染将siRNA或miRNA被动地装载到分离的外泌体中并不适合对大分子蛋白质进行操作。
[0004]而间充质干细胞由于易分化、传代次数有限和培养成本高等缺点，其分泌的外泌体更被限制了在临床治疗上的应用。同时，由于现存技术具有的破坏性和不稳定性，对于提高其内源性治疗性蛋白质的含量成为一大技术难题。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种用于生产外泌体的载体，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供生产外泌体的方法。
[0008]本专利技术的目的之三在于提供生产得到的外泌体。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供上述外泌体的而应用。
[0010]本专利技术提供了用于生产外泌体的载体，包括：
[0011](a)药物载体，包含编码光敏蛋白的核苷酸和编码蛋白质药物的核苷酸；
[0012](b)结合载体，包含编码融合于外泌体膜的特异性蛋白的核苷酸和编码光敏蛋白
结合蛋白的核苷酸。
[0013]进一步的，所述光敏蛋白包括CRY2；
[0014]优选地，编码CRY2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]进一步的，所述蛋白质药物包括eNOS；
[0016]优选地，编码eNOS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]进一步的，所述融合于外泌体膜的特异性蛋白包括CD9；
[0018]编码CD9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0019]进一步的，所述光敏蛋白结合蛋白包括CIBN；
[0020]优选地，编码CIBN的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0021]进一步的，所述药物载体和结合载体还分别独立地包含编码标签蛋白的核苷酸；
[0022]优选地，所述药物载体中的标签蛋白包括mCherry；
[0023]优选地，所述结合载体中的标签蛋白包括EGFP。
[0024]本专利技术还提供了生产外泌体的方法，包括如下步骤：
[0025](A)在外泌体生产细胞中导入上述的载体；
[0026](B)用能够引起所述光敏蛋白和光敏蛋白结合蛋白缔合的光照射(A)得到的外泌体生产细胞；
[0027](C)提取(B)处理后的外泌体生产细胞生产的外泌体。
[0028]进一步的，所述外泌体生产细胞包括干细胞，优选为人脐带间充质干细胞；
[0029]优选地，所述光为蓝光，发射波长为460nm～465nm；
[0030]优选地，所述照射时间为48～72h，照射方式为一分钟蓝光照射和一分钟黑暗交替；
[0031]优选地，使用超速离心法提取外泌体；
[0032]优选地，所述提取方法包括在8000～12000
×
g条件下离心25～35分钟后，过滤上清液，然后将上清液在80000～120000
×
g条件下离心1.2～1.8小时1～3次，得到的沉淀为外泌体。
[0033]本专利技术还提供了应用上述的生产外泌体的方法得到的外泌体。
[0034]此外，本专利技术还提供了上述的外泌体在如下(i)或(ii)中的应用：
[0035](i)抗氧化应激；
[0036](ii)促进创面愈合。
[0037]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0038]本专利技术提供的用于生产外泌体的载体，通过特定组成的药物载体和结合载体，能够实现在外泌体膜上的直接连接，相比于传统技术中插入在生产外泌体细胞中的外源基因载体，应用其可以有效地制备高表达目的蛋白的外泌体。
[0039]本专利技术提供的生产外泌体的方法，应用了本专利技术提供的用于生产外泌体的载体，其中蛋白质药物可以通过内源性生物生成过程主动装载到干细胞来源外泌体中，通过可控、可逆地从外泌体中分离出来，从而有效地运送到目标细胞中。
附图说明
[0040]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0041]图1为本专利技术实施例提供的hUCMSCs的表面标记蛋白通过流式细胞仪进行表征的结果图；
[0042]图2A为本专利技术实施例提供的茜素红染色观察无定形钙盐沉积情况的结果图；
[0043]图2B为本专利技术实施例提供的阿尔辛蓝染色检测软骨细胞中多糖和蛋白多糖的结果图；
[0044]图2C为本专利技术实施例提供的油红O染色检测细胞内脂小滴的结果图；
[0045]图3A为本专利技术实施例提供的蓝光刺激下间充质肝细胞内两个光敏蛋白的互作情况；
[0046]图3B为本专利技术实施例提供的外泌体的粒径；
[0047]图3C为本专利技术实施例提供的外泌体的透射电镜图；
[0048]图3D为本专利技术实施例提供的不同功率的蓝光照射下外泌体负载eNOS的情况；
[0049]图3E为本专利技术实施例提供的不同处理的外泌体的生物标志物；
[0050]图3F为本专利技术实施例提供外本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于生产外泌体的载体，其特征在于，包括：(a)药物载体，包含编码光敏蛋白的核苷酸和编码蛋白质药物的核苷酸；(b)结合载体，包含编码融合于外泌体膜的特异性蛋白的核苷酸和编码光敏蛋白结合蛋白的核苷酸。2.据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述光敏蛋白包括CRY2；优选地，编码CRY2的核苷酸序列如atgaagatggacaaaaagactatagtttggtttagaagagacctaaggattgaggataatcctgcattagcagcagctgctcacgaaggatctgtttttcctgtcttcatttggtgtcctgaagaagaaggacagttttatcctggaagagcttcaagatggtggatgaaacaatcacttgctcacttatctcaatccttgaaggctcttggatctgacctcactttaatcaaaacccacaacacgatttcagcgatcttggattgtatccgcgttaccggtgctacaaaagtcgtctttaaccacctctatgatcctgtttcgttagttcgggaccataccgtaaaggagaagctggtggaacgtgggatctctgtgcaaagctacaatggagatctattgtatgaaccgtgggagatatactgcgaaaagggcaaaccttttacgagtttcaattcttactggaagaaatgcttagatatgtcgattgaatccgttatgcttcctcctccttggcggttgatgccaataactgcagcggctgaagcgatttgggcgtgttcgattgaagaactagggctggagaatgaggccgagaaaccgagcaatgcgttgttaactagagcttggtctccaggatggagcaatgctgataagttactaaatgagttcatcgagaagcagttgatagattatgcaaagaacagcaagaaagttgttgggaattctacttcactactttctccgtatctccatttcggggaaataagcgtcagacacgttttccagtgtgcccggatgaaacaaattatatgggcaagagataagaacagtgaaggagaagaaagtgcagatctttttcttaggggaatcggtttaagagagtattctcggtatatatgtttcaacttcccgtttactcacgagcaatcgttgttgagtcatcttcggtttttcccttgggatgctgatgttgataagttcaaggcctggagacaaggcaggaccggttatccgttggtggatgccggaatgagagagctttgggctaccggatggatgcataacagaataagagtgattgtttcaagctttgctgtgaagtttcttctccttccatggaaatggggaatgaagtatttctgggatacacttttggatgctgatttggaatgtgacatccttggctggcagtatatctctgggagtatccccgatggccacgagcttgatcgcttggacaatcccgcgttacaaggcgccaaatatgacccagaaggtgagtacataaggcaatggcttcccgagcttgcgagattgccaactgaatggatccatcatccatgggacgctcctttaaccgtactcaaagcttctggtgtggaactcggaacaaactatgcgaaacccattgtagacatcgacacagctcgtgagctactagctaaagctatttcaagaacccgtgaagcacagatcatgatcggagcagcacctgatgagattgtagcagatagcttcgaggccttaggggctaataccattaaagaacctggtctttgcccatctgtgtcttctaatgaccaacaagtaccttcggctgttcgttacaacgggtcaaagagagtgaaacctgaggaagaagaagagagagacatgaagaaatctaggggattcgatgaaagggagttgttttcgactgctgaatcttcttcttcttcgagtgtgtttttcgtttcgcagtcttgctcgttggcatcagaagggaagaatctggaaggtattcaagattcatctgatcagattactacaagtttgggaaaaaatggttgcaaatga所示(SEQ ID NO.1)。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述蛋白质药物包括eNOS；优选地，编码eNOS的核苷酸序列如atgggcaacttgaagagcgtggcccaggagcctgggccaccctgcggcctggggctggggctgggccttgggctgtgcggcaagcagggcccagccaccccggcccctgagcccagccgggccccagcatccctactcccaccagcgccagaacacagccccccgagctccccgctaacccagcccccagaggggcccaagttccctcgtgtgaagaactgggaggtggggagcatcacctatgacaccctcagcgcccaggcgcagcaggatgggccctgcaccccaagacgctgcctgggctccctggtatttccacggaaactacagggccggccctcccccggccccccggcccctgagcagctgctgagtcaggcccgggacttcatcaaccagtactacagctccattaagaggagcggctcccaggcccacgaacagcggcttcaagaggtggaagccgaggtggcagccacaggcacctaccagcttagggagagcgagctggtgttcggggctaagcaggcctggcgcaacgctccccgctgcgtgggccggatccagtgggggaa
gctgcaggtgttcgatgcccgggactgcaggtctgcacaggaaatgttcacctacatctgcaaccacatcaagtatgccaccaaccggggcaaccttcgctcggccatcacagtgttcccgcagcgctgccctggccgaggagacttccgaatctggaacagccagctggtgcgctacgcgggctaccggcagcaggatggctctgtgcggggggacccagccaacgtggagatcaccgagctctgcattcagcacggctggaccccaggaaacggtcgcttcgacgtgctgcccctgctgctgcaggccccagatgatcccccagaactcttccttctgccccccgagctggtccttgaggtgcccctggagcaccccacgctggagtggtttgcagccctgggcctgcgctggtacgccctcccggcagtgtccaacatgctgctggaaattgggggcctggagttccccgcagcccccttcagtggctggtacatgagcactgagatcggcacgaggaacctgtgtgaccctcaccgctacaacatcctggaggatgtggctgtctgcatggacctggatacccggaccacctcgtccctgtggaaagacaaggcagcagtggaaatcaacgtggccgtgctgcacagttaccagctagccaaagtcaccatcgtggaccaccacgccgccacggcctctttcatgaagcacctggagaatgagcagaaggccagggggggctgccctgcagactgggcctggatcgtgccccccatctcgggcagcctcactcctgttttccatcaggagatggtcaactatttcctgtccccggccttccgctaccagccagacccctggaaggggagtgccgccaagggcaccggcatcaccaggaagaagacctttaaagaagtggccaacgccgtgaagatctccgcctcgctcatgggcacggtgatggcgaagcgagtgaaggcgacaatcctgtatggctccgagaccggccgggcccagagctacgcacagcagctggggagactcttccggaaggcttttgatccccgggtcctgtgtatggatgagtatgacgtggtgtccctcgaacacgagacgctggtgctggtggtaaccagcacatttgggaatggggatcccccggagaatggagagagctttgcagctgccctgatggagatgtccggcccctacaacagctcccctcggccggaacagcacaagagttataagatccgcttcaacagcatctcctgctcagacccactggtgtcctcttggcggcggaagaggaaggagtccagtaacacagacagtgcaggggccctgggcaccctcaggttctgtgtgttcgggctcggctcccgggcatacccccacttctgcgcctttgctcgtgccgtggaca...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟晓洲，赵鑫，蔡宇，陈晓怡，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：