一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物技术

本发明专利技术涉及细胞技术领域，具体涉及一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物。通过至少一种质粒载体将编码后的CD16基因序列导入iPSC并最终分化为NK细胞，所获得的NK细胞具有增强的细胞表型及ADCC效果。的NK细胞具有增强的细胞表型及ADCC效果。的NK细胞具有增强的细胞表型及ADCC效果。

【技术实现步骤摘要】
一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物


[0001]本专利技术属于细胞
，具体涉及到一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物。

技术介绍

[0002]NK细胞是一种具有肿瘤细胞杀伤能力的天然免疫细胞类型，在肿瘤免疫细胞治疗领域有着重要的应用。按照来源分类，目前肿瘤免疫细胞治疗领域使用的NK细胞绝大多数是通过在捐献者或者患者身上提取外周血细胞(PBMC)，然后通过体外分离、改造、扩增，获得最后的NK细胞产品。但是在工业界，药企和生物制药公司必须要考虑到产品的生产成本和原材料来源。外周血来源于患者或者捐献者，而NK细胞在外周血中的占比只有5
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10％，这很大程度上限制了稳定的供应来源。并且通过PBMC获取的NK细胞其标志物表达及杀伤效果都不是很理想。因此我们引进iPSC细胞，iPSC可以在体外无限增殖并分化为功能性NK细胞，因此iPSC技术为获得大批量质量稳定的免疫细胞提供了有潜力的解决方案。
[0003]在实际应用方面，iPSC细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎，这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPSC来源的NK细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。
[0004]但是存在一个现实问题，即未经基因修饰的iPSC细胞分化为NK细胞，它们在其细胞表面的CD16表达偏低，无法通过抗体依赖性细胞毒性效应即ADCC机制裂解靶细胞。

技术实现思路

[0005]本申请提供一种CD16高表达、ADCC功能增强的NK细胞的制作方法、NK细胞及其组合物，本方案的优点在于：基于两种质粒系统均可实现将编码后的CD16基因导入到iPSC细胞基因组中。并成功分化为NK细胞，获得CD16
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NK细胞系，实现CD16表达稳定，ADCC功能增强，NK细胞纯度高等优点。具体详细说明如下：
[0006]为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为：一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，包括如下步骤：
[0007]步骤一：通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中，得到CD16高表达的iPSC细胞株；
[0008]步骤二：将上述步骤中得到的CD16高表达的iPSC细胞株分化为NK细胞；
[0009]其中，步骤一中能够表达CD16的质粒至少有一种。
[0010]进一步改进在于，表达CD16的质粒可以是基于转座子插入系统的Piggybac质粒或是基于同源重组的模板质粒。
[0011]进一步改进在于，表达的CD16为具有抗体Fc段高亲和力且不可切割的突变体。
[0012]进一步改进在于，CD16基因序列的突变位点为F158V和位点S197P。
[0013]进一步改进在于，CD16基因序列为SEQ ID NO:1。
[0014]进一步改进在于，表达CD16的基于转座子插入系统的Piggybac质粒需要与PBase
质粒共转染，最终获得CD16
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PiggyBac质粒。
[0015]进一步改进在于，PiggyBac质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记的序列为SEQ ID NO:3。
[0016]进一步改进在于，表达CD16的基于转座子插入系统的PiggyBac质粒，将其命名为CD16
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PiggyBac质粒，序列为SEQ ID NO:4。
[0017]进一步改进在于，其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR
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sgRNA质粒共转染；表达CD16的基于同源重组的模板质粒，将其命名为AAVS1
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CD16
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Puc57质粒。
[0018]进一步改进在于，其中，靶向AAVS1的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
[0019]进一步改进在于，其中表达CD16的基于同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记，Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂序列，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂序列；其中，Ef1a启动子序列为SEQ ID NO:2，抗性筛选标记序列为SEQ ID NO:3；左、右同源臂序列可设置为两组，组1中的左侧同源臂长度为400bp，右侧同源臂长度为600bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12，；组2中的左侧同源臂长度为500bp，右侧同源臂长度为500bp，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:14，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:15。
[0020]进一步改进在于，所述表达CD16的基于同源重组的模板质粒，即AAVS1
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CD16
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Puc57质粒的序列为SEQ ID NO:13。
[0021]进一步改进在于，所述CD16高表达的iPSC细胞株通过抗生素筛选和一次的克隆挑选即可获得，所得的iPSC细胞株中CD16的表达不低于85％。其中，抗生素优选为嘌呤霉素，即puromycin。
[0022]本专利技术还公开一种ADCC功能增强的NK细胞，通过上述步骤获得的NK细胞，其CD16的表达不低于80％。
[0023]本专利技术还公开一种组合物，包括ADCC功能增强的NK细胞，所述ADCC功能增强的NK细胞是通过上述方法制作获得。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0025](1)本专利技术可将编码CD16的基因序列通过PiggyBac质粒系统或同源重组的模板质粒成功导入到iPSC基因组中；通过电转的方式成功获得CD16
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iPSC稳定表达的细胞株。
[0026](2)稳定表达的iPSC细胞株能够成功分化为NK细胞，其获得的NK细胞的CD16+表达大于等于80％，且表达稳定；采用本方法的基因修饰及分化，成功构建了CD16
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NK细胞系。
[0027](3)基于进一步验证，本方案获得的NK细胞的ADCC杀伤率可达60％以上，是未经基因修饰后分化获得的NK细胞ADCC杀伤率的2.8倍左右；可证实通过本方案最终获得的NK细胞的ADCC功能增强，提高了NK细胞的自然杀伤效果。能够用于制备预防或治疗免疫缺陷、以及治疗肿瘤的药物。
[0028](4)将表达CD16的两种质粒导入到iPSC中后仅通过一次单克隆的挑取即可得到CD16+高表达的CD16
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iPSC的细胞株；步骤简单，效果明确。
[0029](5)通过本方案获得的NK细胞，其CD56+表达高，说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：Ⅰ、通过电转将表达CD16的质粒导入到iPSC中，得到CD16高表达的iPSC细胞株；Ⅱ、将步骤Ⅰ中得到的CD16高表达的iPSC细胞株分化为NK细胞；其中，能够表达CD16的质粒是基于同源重组的模板质粒；CD16的基因序列突变位点为F158V和位点S197P，突变后的碱基序列分别是gtt和cca；基于同源重组的模板质粒需要与靶向AAVS1位点的CRISPR
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sgRNA共转染。2.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，靶向AAVS1位点的sgRNA序列为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。3.如权利要求1所述的一种ADCC功能增强的NK细胞的制作方法，其特征在于，同源重组的模板质粒的构建方式为编码CD16的序列前为Ef1a启动子，编码CD16的序列后为PuroR抗性筛选标记， Ef1a启动子之前为AAVS1左侧同源臂，PuroR抗性筛选标记之后为AAVS1右侧同源臂；同源臂序列设置两组，左侧同源臂序列为SEQ ID NO:11，右侧同源臂序列为SEQ ID NO:12；或是左侧同源臂序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛文雪，王嘉显，
申请(专利权)人：南京艾尔普再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：