一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法：（1）构建表达人源化DLL4的打靶载体；（2）设计并获得针对小鼠Dll4基因Exon1至Exon9部分的sgRNA；（3）将打靶载体、sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配种繁殖获得F1小鼠，筛选出DLL4人源化小鼠模型。本发明专利技术构建的DLL4人源化小鼠在肿瘤学、免疫学等领域具有应用价值。免疫学等领域具有应用价值。免疫学等领域具有应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及动物基因工程领域，具体涉及一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来肿瘤免疫疗法的概念已经越来越被大众熟知，但新型免疫治疗药物的研发仍面临诸多挑战。由于一般特异性人源蛋白的抗体不能识别小鼠内源蛋白，普通野生型小鼠无法作为测试这些药物的体内模型。由于物种特异性限制，抗小鼠抗体制剂不能反映同类生物制剂在人体内的实际疗效。这些问题阻碍了免疫疗法的临床前评估，限制了新型肿瘤免疫药物研发的进展。因此，研究者们开始致力于人源化小鼠模型的开发。
[0003]人源化小鼠是携带功能性人类基因、细胞、组织和/或器官、免疫系统或微生物的小鼠，其用于生物医学研究和临床治疗方案的开发。有些人源化小鼠携带人类细胞，有些则与人类具有某些一致的遗传和生理特性。由于小鼠基因组与人类基因组高度相似，且更易于操作和改变，因此小鼠可以方便地模拟人类的生物学特性和人类疾病，从而帮助研发人员破译致病原理和其分子机制，为药物的开发指引方向。
[0004]δ样蛋白4（DLL4）是一种I型跨膜蛋白，其细胞外结构域包含一个Delta和Serrate（DSL）配体结构域和八个串联的表皮生长因子样重复序列。在与其配体Notch 1和Notch 4结合后，胞外结构域和胞质结构域被裂解，胞质结构域被转入细胞核。DLL4在生理性和病理性血管生成的部位均有表达。在Dll4启动子控制下携带lacz报告子的小鼠显示肿瘤血管系统中Dll4的表达显著增加。在人类肿瘤中，DLL4在透明细胞肾细胞癌的血管系统中表达增加，以及在浅表性和浸润性膀胱癌中表达。在培养的内皮细胞、临床前肿瘤模型和人类肿瘤样本中，VEGF和DLL4的表达密切相关。根据这些观察结果，我们很容易推测DLL4/Notch通路可能参与了肿瘤血管生成。
[0005]DLL4不仅在血管发育和稳态中至关重要，而且在肿瘤功能性血管网络的形成中也极其重要。在临床前小鼠模型中，阻断Dll4介导的Notch信号可显著增加非生产性血管生成，但显著抑制肿瘤生长。因此，DLL4已成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点。抗DLL4抗体最近已进入临床试验阶段。然而，抗DLL4的潜在毒性作用尚不清楚。已有文献报道慢性DLL4阻断异常激活内皮细胞，引起多器官病理改变，诱发血管肿瘤。这些发现需要在使用不同肿瘤动物的研究中得到证实，但是对于使用抗DLL4药物提出了重要的安全性问题，并值得在靶向DLL4的临床试验中监测这些作用。
[0006]人源化小鼠可模拟人类疾病，因此通常被用于传染病、退行性和癌症疾病的研究。最近的模型还反映了造血、自然免疫、神经生物学和影响疾病病理生物学的分子途径。一系列免疫缺陷小鼠品系允许长寿命的人类祖细胞移植。先天性和适应性免疫的存在使高水平的人血淋巴重构成为可能，细胞对广泛的微生物感染具有敏感性。这些小鼠还有助于研究人类病理生物学，自然疾病过程和广泛人类疾病的治疗效果。因此，利用基因编辑的手段将编码人类DLL4的基因敲入到其同源C57BL/6JGpt小鼠位点，可以构建表达人DLL4细胞因子
的小鼠模型，该小鼠模型在研究免疫治疗、炎症、自身免疫疾病及相关药物筛选方面具有应用价值。
[0007]目前暂未见DLL4人源化小鼠模型构建方法及其在靶点药物应用方面的相关文献报道。

技术实现思路

[0008]针对目前存在的问题，本专利技术的第一方面提供一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法包括如下步骤：（1）构建表达人源化DLL4的打靶载体，用于人源化DLL4基因的插入；（2）设计针对小鼠Dll4基因Exon1至Exon9部分的sgRNA，利用体外转录技术获得上述sgRNA；（3）将步骤（1）构建的打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配种繁殖获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出DLL4人源化小鼠模型。
[0009]优选的，所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源DLL4基因的结构及功能，选取人源DLL4基因的信号肽及胞外区替换鼠源Dll4基因的信号肽及胞外区序列，选取的人源DLL4基因氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源Dll4基因氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010]优选的，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源DLL4基因的Exon1至Exon9部分替换小鼠Dll4基因的Exon1至Exon9部分，选取的人源DLL4基因序列如SEQ ID No.3所示。
[0011]优选的，所述步骤（1）中构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示。
[0012]优选的，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为（a）SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7，或者（b）SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。
[0013]更优选的，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。
[0014]优选的，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为B6小鼠。
[0015]优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的5
’
端鉴定引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，3
’
端鉴定引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
[0016]优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应体系如下：。
[0017]优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应条件如下：
。
[0018]本专利技术的第二方面提供上述构建方法得到的小鼠在研究DLL4基因相关功能和作用机制中的应用。
[0019]优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。
[0020]本专利技术的第三方面提供上述构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与DLL4基因相关疾病的药物中的应用。
[0021]优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。
[0022]本专利技术的有益效果：本专利技术根据人源DLL4蛋白功能域及人鼠同源性比较，使用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6JGpt（B6）背景的小鼠上将鼠源Dll4基因的信号肽和细胞外结构域替换为人DLL4基因的相应区域。嵌合的DLL4基因序列将在内源性调控机制的指导下表达。该模型在肿瘤学、免疫学等领域具有应用价值。
附图说明
[0023]图1是DLL4人源化小鼠模型策略图；图2是DLL4
‑
KI
‑
target F0小鼠5
’
端和3
’
端基因鉴定结果电泳图；图3是DLL4
‑
KI
‑
target F1小鼠5
’
端和3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：（1）构建表达人源化DLL4的打靶载体，用于人源化DLL4基因的插入；（2）设计针对小鼠Dll4基因Exon1至Exon9部分的sgRNA，利用体外转录技术获得上述sgRNA；（3）将步骤（1）构建的打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配种繁殖获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出DLL4人源化小鼠模型。2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源DLL4基因的结构及功能，选取人源DLL4基因的信号肽及胞外区替换鼠源Dll4基因的信号肽及胞外区序列，选取的人源DLL4基因氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源Dll4基因氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源DLL4基因的Exon1至Exon9部分替换小鼠Dll4基因的Exon1至Exon9部分，选取的人源DLL4基因序列如SEQ ID No...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢俊，汪慧怡，琚存祥，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：