【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于模式动物领域，具体涉及一种人源egfr-t790m-c797s-l858r自发肺癌小鼠模型的构建方法及其应用。
技术介绍
1、egfr突变存在于多种人类恶性肿瘤中，包括非小细胞肺癌(突变频率较高)、胰腺癌和结直肠癌等。常见的egfr突变包括l858r和del19，可以通过靶向药物(如吉非替尼、阿法替尼)进行有效治疗。然而，通过这些靶向药物治疗后，大部分患者会出现耐药的问题，其中t790m突变是主要耐药机制之一。t790m突变位于egfr酪氨酸激酶结构域中，使得egfr靶向抑制剂难以结合于该结构域，从而降低药物的疗效。针对t790m突变的治疗策略主要包括第三代egfr tki(如奥西替尼、纳武利尼)和egfr酪氨酸激酶结构域突变特异性抑制剂(如鲁索替尼)。第三代egfr tki通过能够抑制t790m突变而有效治疗耐药患者，为这一领域带来了重大突破。然而患者还是不可避免地产生了耐药，其中c797s突变为主要耐药机制之一。c797s突变导致egfr对包括第三代egfr tki在内的广谱抑制剂产生耐药性。c797s突变会改变egfr蛋白质结构，从而降低抑制剂与其的亲和性，导致肿瘤细胞不受抑制而继续生长。目前对于c797s突变的治疗缺乏特异性药物，但仍在积极研究中。研究人员正在探索开发新型的egfr抑制剂，能够克服c797s突变引起的耐药问题，并通过个体化治疗策略来提高治疗效果。
2、egfr-t790m-c797s-l858r是一种特定的egfr基因突变，该突变常见于非小细胞肺癌患者中。它被认为是导致egfr抑
技术实现思路
1、为了助力研究egfr突变和肿瘤发生的关系，本专利技术利用基因编辑技术，将人源egfr基因的t790m、l858r和c797s突变导入小鼠，成功构建了c57bl/6jgpt-loxp-stop-loxp-hegfr-t790m-c797s-l858r(简称b6-hegfr-t790m-c797s-l858r)自发肿瘤模型。在表达cre重组酶的组织和细胞内，floxed stop元件将在基因组中被删除，hegfr-t790m-c797s-l858r蛋白以内源性水平开启表达。b6-hegfr-t790m-c797s-l858r模型可以模拟人类肿瘤中的egfr-t790m-c797s-l858r突变情况，进而深入了解该突变对肿瘤生长、恶化和治疗耐药的影响，从而为肿瘤的治疗寻找新的方法。
2、本专利技术的第一目的是提供一种人源egfr-t790m-c797s-l858r突变自发肺癌动物细胞的构建方法，包括如下步骤：
3、(1)构建包含人源egfr-t790m-c797s-l858r基因的同源打靶载体，所述人源egfr-t790m-c797s-l858r基因序列如seq id no：1所示；
4、(2)基于crispr/cas9技术，制备cas9或其表达载体，在动物基因组插入位点设计一组sgrna或者tracrrna/crrna二元复合体或各自的表达载体；
5、或者，制备cas9、sgrna或者crrna和tracrrna的共表达载体；
6、(3)将步骤(1)制备得到的同源打靶载体和步骤(2)制备得到的cas9、sgrna或者tracrrna/crrna二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体注射入动物受精卵，将人源egfr-t790m-c797s-l858r插入到基因组。
7、上述的构建方法，所述动物为哺乳动物，优选为啮齿类动物，更优选为小鼠，如balb/c、ncg、fvb、c3h、dba或c57bl/6。本专利技术一个具体的示例，所述动物为c57bl/6小鼠。
8、本专利技术一个优选的方案，所述动物基因组插入位点为小鼠6号染色体上的rosa26位点(一个外源基因插入的安全位点)。人源hegfr-t790m-l858r-c797s整合到该位点后可以稳定、高效地在小鼠体内表达，而不会破坏内源基因的功能。
9、优选的，同源打靶载体还包含启动子和loxp调控元件。
10、本专利技术一个具体的方案，人源携带t790m、c797s和l858r突变的egfr基因序列、cag启动子序列以及loxp-stop-loxp序列共同构建的载体序列如seq id no.2所示。(1732bp～3451bp序列片段是cag,3452bp～3485bp和5080bp～5113bp是loxp位点的序列,3486bp～5079bp是stop序列,5134bp～5142bp为kozak序列,5143bp～8775bp是egfr序列,8776bp～9007bp为bgh pa序列)。
11、本专利技术对设计的sgrna进行了筛选优化，一个优选的方案，所述sgrna的序列如seqid no:5和6所示。
12、本专利技术的第二目的在于提出基于人源egfr-t790m-l858r-c797s突变自发肺癌模型的构建方法，采用上述方法制备得到的人源egfr-t790m-c797s-l858r自发肺癌动物受精卵移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为f0代动物，经基因型鉴定正确的f0代动物性成熟后与同背景野生型动物配繁获得f1代，即为人源egfr-t790m-c797s-l858r自发肺癌动物模型。
13、本专利技术的第三目的在于提出本专利技术所述动物模型在抗肿瘤药物活性筛选及评价中的应用。
14、本专利技术技术效果
15、1.本专利技术利用cripr/cas9基因编辑技术将人源egfr-t790m-c797s-l858r基因序列、cag启动子序列以及loxp-stop-loxp序列共同构建载体。并以c57bl/6jgpt小鼠为背景鼠，将载体导入到c57bl/6jgpt小鼠中，最终成功获得了b6-hegfr-t790m-c797s-l858r小鼠模型。所述模型可在特定组织或细胞，特定时间表达人源egfr-t790m-l858r-c797s蛋白。
16、2.目前市场上针对hegfr-t790m-c797s-l858r基因开发的药物越来越多，靶向该靶点的候选药物在越来越多的疾病中凸显治疗潜力。本专利技术所述模型能够助力肿瘤学、药物筛选和治疗等研究，能够测试相应药物的疗效与安全性，有助于缩短药物开发和应用的周期并加速药物研究。
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1.一种人源EGFR-T790M-C797S-L858R自发肺癌动物细胞的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述动物为啮齿类动物。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述动物为小鼠。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述动物为BALB/c、NCG、FVB、C3H、DBA或C57BL/6小鼠。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述动物基因组插入位点为小鼠6号染色体上的Rosa26位点。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于同源打靶载体还包含启动子和Loxp调控元件。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于同源打靶载体的序列如SEQ ID No:2所示。
8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于sgRNA的序列如SEQ ID No:5和6所示。
9.一种人源EGFR-T790M-C797S-L858R自发肺癌动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的人源EGFR
10.根据权利要求9所述构建方法制备得到的人源EGFR-T790M-C797S-L858R自发肺癌动物模型在抗肿瘤药物活性筛选及评价中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种人源egfr-t790m-c797s-l858r自发肺癌动物细胞的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述动物为啮齿类动物。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述动物为小鼠。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述动物为balb/c、ncg、fvb、c3h、dba或c57bl/6小鼠。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述动物基因组插入位点为小鼠6号染色体上的rosa26位点。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于同源打靶载体还包含启动子和loxp调控元件。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于同源打靶载体的序列如seq...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢俊，漆豪，杨笑柳，汪慧怡，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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