一种平衡染色体动物模型的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种近乎完整染色体倒置的平衡染色体以及具有平衡染色体动物模型的构建方法，使用位点特异性重组酶系统介导的重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点，该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A；在端粒侧插入片段2，包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点，该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经相应的位点特异性重组酶诱导实现两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。本发明专利技术所述方法可用于建立所有染色体近乎全部倒置的平衡染色体动物品系。体动物品系。

【技术实现步骤摘要】
一种平衡染色体动物模型的构建方法


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种平衡染色体，特别是整条染色体倒置，以获得平衡染色体小鼠模型，并通过繁育获得染色体全部倒置的小鼠模型。

技术介绍

[0002]平衡染色体(Balancer Chromosome)是经特殊修饰过的染色体，最先被应用在果蝇的遗传学研究，平衡染色体通常包含倒置的染色体片段，姐妹染色单体在倒置区不会发生同源重组，因此，平衡染色体可用于保存筛选到的突变，包括隐性致死突变，维持基因杂合性(Boles,M.K.,et al.,A mouse chromosome 4balancer ENU
‑
mutagenesis screen isolates eleven lethal lines.BMC genetics,2009.10:p.12
‑
12.)。平衡染色体为遗传学家提供了一种可靠的方法，可以从遗传学角度筛选生物的突变并使其保持恒定，如图1(说明：[B,C,D]和[G]是倒置的染色体片段，正常的基因同源重组(大X))。在倒置片段处被抑制(小X)。
[0003]平衡染色体的工作原理是：在减数分裂期间，倒转的基因片段能够抑制姐妹染色单体重组事件时交叉互换的重组产物的恢复。染色体倒置可通过两种方式阻止交叉互换后染色体的恢复完整。首先，在倒置染色体附近很难形成染色体的交叉联会。其次，存在染色体联会时，在染色体的联会区，内翻的倒置基因出现交叉重组互换会导致产生两个无法遗传的染色体(一条具有两个着丝粒，一条无着丝粒)，由此产生的非整倍体配子不能产生正常后代。如图2所示。(Miller,D.E.,et al.,Rare recombination events generate sequence diversity among balancer chromosomes in Drosophila melanogaster.Proceedings of the National Academy of Sciences,2016.113(10):p.E1352
‑
E1361.)
[0004]平衡染色体倒置区越大，够保存其配对的同源染色体上的基因越多。科学家在制作倒置染色体时，面临的问题是随着倒置的目的基因区域变大，获得倒置成功的概率逐渐降低接近于0。原因在于介导倒置的Cre/loxP介导的重组效率随着遗传距离增大而降低，当loxP囊括的染色体长度大致达到60cM(～94Mb)时，获得重组的概率为8.3
±
0.8
×
10
‑5(Zheng,B.,et al.,Engineering mouse chromosomes with Cre
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loxP:range,efficiency,and somatic applications.Molecular and cellular biology,2000.20(2):p.648
‑
655.)。
[0005]孙磊等人设计了利用Cre/loxP系统，设计基于4个不同的插入框架，通过多次电转，先后完成3个倒位，分别培育出含有远端倒位和近端倒位的小鼠,利用体内减数分裂自然同源重组的方法使它们重组到同一条染色体上,再分离相应的ES细胞。(孙磊，复旦大学，博士学位论文，2007，《小鼠17号染色体全长有丝分裂重组系统构建以及平衡染色体初探》)。
[0006]目前已有的小鼠平衡染色体都只是覆盖了某条染色体的一部分,即便是小鼠11号
染色体也是通过三条独立的平衡染色体才覆盖了86％的区域,还不能满足进行全基因组或全长染色体遗传筛选的要求。
[0007]现有技术下使用分段倒置的技术思路存在很大的缺陷。首先，在同一细胞上进行多段插入，无法有效保证插入的每个片段在同一个染色体上，增加的片段数越多，概率越低。仅当这些片段都插入在同一个染色体上，该Cre/loxP系统才能工作，获得倒置。其次，在孙磊公开的文献中，每一段序列的插入都需要使用一种抗性标记，每一段插入后，需要进行一次Cre电转将抗性删除，如此进行，ES细胞需要经历的基因打靶次数倍数增加，而ES细胞在进行连续打靶会大大影响其全能性和遗传能力，造成无法获得小鼠。同时，采用多段插入，还面临双交换的风险，插入的片段越多，风险越大。此外，由于分段倒置每段来源不同的细胞产生的小鼠，分段片段不在同一个染色体上，利用小鼠配繁的过程中自然产生跨越整个染色体的同源重组概率在理论上极低。
[0008]目前尚无理想、有效的，进行完整染色体倒置的平衡染色体构建方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对现有技术不足，提供了一种完整染色体倒置的平衡染色体以及具有平衡染色体动物模型的构建方法，可用于建立全部染色体倒置的平衡染色体动物品系。
[0010]本专利技术具体技术方案如下：
[0011]一种平衡染色体的构建方法，使用位点特异性重组酶系统介导的位点特异性重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点，该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A，在端粒侧引入片段2，包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点，该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经位点特异性重组酶诱导实现两个位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。
[0012]本专利技术所述的构建方法适用于各种长度的染色区域倒置，特别适用于整条染色体(超过190Mb染色体区域)的倒置。
[0013]为了实现近整条染色体的倒置，片段1插入位置在着丝粒一端，优选位于着丝粒序列下游0～50Mbp处，片段2插入位置在端粒一端，位于端粒序列上游0～50M bp处。
[0014]由于位点特异性重组酶系统(如Cre/loxP)介导的重组效率随着遗传距离增大而降低，为了提高筛选的精准性，本专利技术基于正选择标记基因的筛选思路，敲除原表达系统中正选择标记基因，将正选择标记基因表达元件分割为两段独立的含有编码区的片段，并将下游部分的编码区片段序列反向，分别放置于片段1和2的位点特异性重组酶系统识别位点的上游。经位点特异性重组酶系统工具酶诱导实现两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，原正选择标记基因反向的下游部分的编码区片段经倒置转为正向序列，连接在片段1的位点特异性重组酶系统识别位点之后，与正选择标记基因的上游部分的编码区实现正选择标记基因的表达，利用正选择标记基因抗性的药物(如HAT(胸苷激酶基因选择法)筛选或抗生素药物压力筛选)，筛选得到平衡染色体阳性克隆。
[0015]基于上述构思，将所述正选择标记基因表达元件分割成两段编码区，片段A和B，可以分割为正选择标记基因表达启动子和正选择标记基因，或者在正选择标记基因的内含子部分进行分割，得到的片段A为正选择标记基因表达启动子+正选择标记基因编码区(部
分)，片段B为正选择标记基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种平衡染色体的构建方法，其特征在于使用Cre/LoxP系统介导的位点特异性重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括loxP位点，loxP位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A，在端粒侧引入片段2，包括反向的loxP位点，反向的loxP位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经Cre工具酶诱导实现两个loxP位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体；所述正选择标记基因表达元件片段A和B为正选择标记基因表达元件分割得到的两个基因片段，两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，片段1的位点特异性重组酶系统识别位点位于正选择标记基因表达元件两个片段之间，不影响正选择标记基因的表达。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于片段1插入位置位于着丝粒序列下游0
‑
50Mbp处，片段2插入位置位于端粒序列上游0
‑
50Mbp处。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述正选择标记基因选自Neo、Hph、Gpt、Hprt、Tk或Puro。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述片段1的5
’
端和3
’
端分别具有正向和反向的被可诱导重组系统工具酶识别的单侧序列，所述片段2的5
’
端和3
’
端分别具有反向和正向的被可诱导重组系统工具酶识别的另一侧序列，当两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，片段2的5
’
端和片段1的3
’
端的可诱导重组系统工具酶识别序列随着染色体倒置...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，张宇曦，张明坤，侯欢欢，赵静，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：