一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，涉及类胚胎致畸物技术领域；为了解决动物胚胎确定致畸物致畸能力的限制问题；具体包括以下步骤：建立

【技术实现步骤摘要】
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法


[0001]本专利技术涉及类胚胎致畸物
，尤其涉及一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法
。

技术介绍

[0002]目前，出生缺陷或先天性畸形是导致婴儿死亡的主要原因之一，占所有婴儿死亡的
20
％，在引起出生缺陷或先天性畸形的因素中，外部环境中存在的致畸物，包括小分子药物
(
如丙戊酸
VPA)、
塑料
(
如增塑剂甲氧基乙醇
MeTH)、
化妆品
(
如邻苯二甲酸二甲酯
DiPH)
等，被认为是十分重要的致畸因素
。
然而，很多常见致畸物对于胚胎发育关键行为的影响及其分子机制还不是很清楚，了解这个问题可以有助于我们探索先天性发育疾病发生发展机制，并可为预防致畸物导致的胚胎畸形提供相关理论依据
。
[0003]有研究显示，致畸物对于着床后胚胎的影响十分显著，基于技术和伦理上的诸多限制，要全面了解不同致畸物对于早期胚胎发育的影响及其分子机制，特别是着床后胚胎发育相关问题，仍然十分困难
。
长期以来，动物胚胎研究一直是确定致畸物致畸能力的主要方法，但存在以下不足：
①
动物胚胎获取技术难
、
耗时长
、
样本少
、
成本高，导致无法高通量地研究各种小分子致畸物对于胚胎发育中形态发生
、
器官形成等关键事件的影响；
②
母体对于致畸物的吸收
、
分布和代谢会因动物种类
、
遗传背景
、
给药途径
、
年龄
、
饮食等而有很大差异，因此很难确定特定小分子化合物在何种浓度下通过何种机制影响特定的发育过程
。
基于上述限制因素，迫切需要一种有效模型和方法来研究各种小分子化合物和药物对合成胚胎的致畸能力
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，包括以下步骤：
[0007]S1
：建立
ES、TS
和
XEN
细胞系，并进行标志性蛋白鉴定；
[0008]S2
：建立特异性钙黏蛋白均一表达细胞系；
[0009]S3
：构建
ETX
胚胎；
[0010]S4
：确立致畸物致畸效应和致畸浓度；
[0011]所述
ETX
胚胎的构建方法，包括培养前处理阶段
、
培养中期阶段和培养后期阶段
。
[0012]优选地：所述
ES、TS
和
XEN
细胞系的建立方法，包括以下内容：
[0013]A1
：取两只以上
E3.5
时期的小鼠胚胎，将其接种于含小鼠胚胎成纤维细胞的滋养层的培养皿中；
[0014]A2
：利用
2iLif
培养基和
TSF4H
培养基分别培养胚胎，1～2周后获得
ES
和
TS
细胞；
[0015]A3
：然后利用
XEN
培养基培养
ES
细胞，2周后
ES
细胞转变为
XEN
细胞
。
[0016]优选地：所述标志性蛋白鉴定的方式为：利用免疫荧光蛋白染色对所获得的
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞进行鉴定，再分别观测
ES
细胞中
Nanog
和
Oct4、TS
细胞中
Cdx2
和
Tfap2c、XEN
细胞中
Gata4
和
Gata6
的表达情况
。
[0017]优选地：所述特异性钙黏蛋白均一表达细胞系的建立方法，包括以下内容：
[0018]B1
：利用
Gateway
克隆法构建基于
PiggyBac
和
Tet
‑
On
可瞬时诱导表达特异性钙黏蛋白的质粒，实现在
ES、TS
和
XEN
细胞中分别表达
Cdh1、Cdh3
和
Cdh6
；
[0019]B2
：添加1μ
g/mL
强力霉素
Dox
诱导特异性钙黏蛋白的表达；
[0020]B3
：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天
、
第2天和第3天，分别利用免疫荧光染色和
qRT
‑
PCR
法对诱导表达的细胞进行表征和评估；
[0021]B4
：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天
、
第2天和第3天，分别通过免疫荧光染色方法检测
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞中
Oct4、Tfap2c
和
Gata4
的表达
。
[0022]优选地：所述培养前处理阶段，包括以下内容：
[0023]C1
：将
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；
[0024]C2
：混合
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞得到混合体，将混合体接种于抗粘附溶液处理过的含基础培养基的
AggreWell
培养板中，离心使混合体均匀分布后再培养
。
[0025]优选地：所述培养中期阶段，包括以下内容：
[0026]C11
：自组装第1天，在
FC
培养基中添加
10M Y
‑
27632
；
[0027]C12
：自组装第2‑4天，使用
IVC1
培养基对于组装体进行培养，并每天替换一半培养基，然后在体式显微镜下选取形态正常的组装体进行后续培养步骤；
[0028]C13
：自组装第5‑7天，使用
EUCM
培养基替换
IVC1
培养基对组装体进行培养
。
[0029]优选地：所述培养后期阶段，包括以下内容：
[0030本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1
：建立
ES、TS
和
XEN
细胞系，并进行标志性蛋白鉴定；
S2
：建立特异性钙黏蛋白均一表达细胞系；
S3
：构建
ETX
胚胎；
S4
：确立致畸物致畸效应和致畸浓度；所述
ETX
胚胎的构建方法，包括培养前处理阶段
、
培养中期阶段和培养后期阶段
。2.
根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述
ES、TS
和
XEN
细胞系的建立方法，包括以下内容：
A1
：取两只以上
E3.5
时期的小鼠胚胎，将其接种于含小鼠胚胎成纤维细胞的滋养层的培养皿中；
A2
：利用
2iLif
培养基和
TSF4H
培养基分别培养胚胎，1～2周后获得
ES
和
TS
细胞；
A3
：然后利用
XEN
培养基培养
ES
细胞，2周后
ES
细胞转变为
XEN
细胞
。3.
根据权利要求2所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述标志性蛋白鉴定的方式为：利用免疫荧光蛋白染色对所获得的
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞进行鉴定，再分别观测
ES
细胞中
Nanog
和
Oct4、TS
细胞中
Cdx2
和
Tfap2c、XEN
细胞中
Gata4
和
Gata6
的表达情况
。4.
根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述特异性钙黏蛋白均一表达细胞系的建立方法，包括以下内容：
B1
：利用
Gateway
克隆法构建基于
PiggyBac
和
Tet
‑
On
可瞬时诱导表达特异性钙黏蛋白的质粒，实现在
ES、TS
和
XEN
细胞中分别表达
Cdh1、Cdh3
和
Cdh6
；
B2
：添加1μ
g/mL
强力霉素
Dox
诱导特异性钙黏蛋白的表达；
B3
：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天
、
第2天和第3天，分别利用免疫荧光染色和
qRT
‑
PCR
法对诱导表达的细胞进行表征和评估；
B4
：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天
、
第2天和第3天，分别通过免疫荧光染色方法检测
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞中
Oct4、Tfap2c
和
Gata4
的表达
。5.
根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述培养前处理阶段，包括以下内容：
C1
：将
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；
C2
：混合
ES
细胞
、TS
细胞和
XEN
细胞得到混合体，将混合体接种于抗粘附溶液处理过的含基础培养基的
AggreWell
培养板中，离心使混合体均匀分布后再培养
。6.
根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：包敏，宋伟宏，
申请(专利权)人：瓯江实验室，
类型：发明
国别省市：