培养并使多能细胞分化为肌肉祖细胞或成熟肌肉细胞的方法和包含所述细胞的组合物技术

本文提供了包含成熟肌肉祖细胞和

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养并使多能细胞分化为肌肉祖细胞或成熟肌肉细胞的方法和包含所述细胞的组合物
专利

[0001]本文提供了包含成熟肌肉祖细胞和
/
或成熟肌肉细胞的人工培养体节
、
获得其的方法和用于快速
、
大规模生产包含成熟肌肉细胞的培养肉类的方法
。
[0002]专利技术背景
[0003]肉类行业是环境和气候恶化的主要原因之一
。
由于世界人口增长和需求增加，肉类消费预计在
1999
年与
2050
年之间将翻一番
。
该行业还与抗生素耐药性和动物源性疾病的发生密切相关
。
虽然完全基于植物的饮食可以被认为是减少环境影响的良好替代方案，但存在很多理由认为，在肉类仍然可得的情况下，世界人口的大多数不会自愿改成这样的饮食
。
培养肉类是使用细胞培养物在体外生产的，为肉类提供了既便宜
、
更道德又环境友好的替代生产方法，但同时保持了特征性味道
、
质地和营养价值，并且甚至与动物源性产品具有相同的生物来源
。
由于骨骼肌是大多数动物肉类中使用的主要可食用组织，因此为了有效生产培养肉类，要求在体外大量生产骨骼肌
。
[0004]Schmidt
等人
(Cellular and Molecular Life Sciences,76:2559
–
2570,2019)
公开了从卫星细胞
>(
骨骼肌的干细胞
)
再生骨骼肌
。
[0005]Suzuki
等人
(Differentiation,96:70
‑
81,2017)
公开了在补充有
100ng/ml FGF
‑2和
100ng/ml EGF
的培养基中，使用经过超过6周的长分化时间段的游离漂浮球形培养物直接
(
无遗传修饰
)
从人类多能细胞衍生肌源性祖细胞的方案
。
[0006]Nachman
等人
(bioRxiv,728642,2019)
公开了控制从中内胚层祖细胞群体内发生定型内胚层细胞
(definitive endoderm cells)
的基本规则，涉及在上皮钙黏素上调之后
Sox17+
细胞的自我分选，其中高表达
Bra
的细胞的小亚群体独立于外部
Wnt
信号地定向至
(committed to)
它们的
Sox17+
命运
。
[0007]对于用于生产体外肌肉细胞
(
优选地在组织结构内
)
的高效
、
快速且成本有效的方法存在尚未满足的需求
。
[0008]专利技术概述
[0009]本文提供了一种基于发育途径的无血清
、
无基因组修饰的用于在培养物中产生体节
、
肌源性祖细胞
、
肌肉细胞和肌肉组织的方案
。
该方案包括从胚胎干细胞起始，在
3D
悬浮细胞培养物中诱导肌肉分化
。
还提供了包含肌肉细胞的培养体节和体节样结构
。
[0010]有利的是，本文公开的用于在培养物中制备肉类产品的方案将胚胎
3D
发育系统在微观尺度上的自我组织特性与生物技术解决方案组合，这使得其非常适用于肉类产品的大规模生产和类器官培养物中的肌肉组织成熟
。
该方案解决了现有的已建立的肌肉分化方案与食品生产的扩大规模和安全性要求之间的巨大差距
。
[0011]令人惊讶的是，本文公开的方案生产体节和体节样结构，它们是在胚胎中产生椎骨和骨骼肌的封闭结构
。
体节的生产具有重要益处
。
首先，体节的生产表明，本文公开的方案
(
方法
/
过程
)
以
3D
悬浮类器官形式良好模拟细胞在胚胎发育期间从多能
(ES)
细胞至完全分化的骨骼肌细胞所经历的发育阶段
。
因此，本文生产的培养组织包括
‘
真正的
’
肉类的所
有特征，即，它主要由肌肉组织构成，但也包括对从家畜生产的肉类的结构和味道有贡献的脂肪细胞
、
结缔组织和血液
。
第二，体节在生产过程中的存在导致类器官内信号传导，这促进所要求的分化而不依赖于外部补充剂，并且因此仅使用少量的生长因子来补充培养基
(
例如，约
10ng/ml
量级
)。
因此，本文公开的方案是成本有效的，因为它不要求大量昂贵的生长因子
(
通常在培养组织的生产中产生主要的支出
)。
[0012]出乎意料的是，对多能细胞应用本文公开的方案导致在短时间范围
(time frame)
内，例如仅在两周内，使用不多于约
20ng/ml
的
FGF
‑2和
EGF
生长因子，产生肌源性祖细胞
。
[0013]此外，由于包括体节形成和肌肉形成的发育过程在脊椎动物中高度保守，因此本文公开的遵循胚胎发育原则的方案可以成功实施，以从任何家畜物种的祖细胞生产培养肉类
。
[0014]最后，本专利技术方案从干细胞起始，并且能够在悬浮液中分化
(
例如，在大规模生物反应器中或甚至在常规转动器
(steerer)
中
)
，直到获得肌源性祖细胞
。
[0015]根据一些实施方案，鉴于上文，本文公开的快速
、
成本有效
、
可重复
、
适用于大规模生物反应器，以及生产包括家畜肉类特征的培养肉的方案，非常适于培养的肌源性祖细胞和培养肉类的工业制造
。
[0016]公开的方案包括一系列步骤，其中每个步骤试图有效地模拟在相关发育阶段由肌源性谱系
(
例如中胚层
、
前体节
(pre
‑
somitic)
中胚层
、
肌源性祖细胞和成熟肌肉细胞
)
感测的体内信号传导环境
。
该方案的第一步包括在第一培养基下使
mES
细胞聚集，然后使悬浮液中的聚集体分化，其中培养基可以在一些相继步骤之间改变，如下文进一步详述和示例的
。
[0017]根据一些实施方案，提供了一种用于产生体节的方法，该方法包括：
[0018](a)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于产生体节的方法，所述方法包括：
(a)
将胚胎干细胞悬浮在培养基中以获得球形聚集体；
(b)
向所述培养基中添加至少一种
Wnt
激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)
去除所述
Wnt
激活剂；
(d)
观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态时，添加细胞外基质或其组分，以获得包含轴旁中胚层的聚集体；以及
(e)
将步骤
(d)
的聚集体孵育
10
至
48
小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体
。2.
根据权利要求1所述的方法，还包括向步骤
(a)
的培养基中添加胰岛素
、Knock
‑
out
血清替代物
、
运铁蛋白
‑
硒和
BMP4
中的一种或更多种
。3.
根据权利要求1‑2中任一项所述的方法，其中所述
Wnt
激活剂选自由以下组成的组：
Chir99021、Wnt3a
和
Rspo3。4.
根据权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中所述向培养基中添加至少一种
Wnt
激活剂在获得所述球形聚集体之后
12
至
36
小时内进行
。5.
根据权利要求1‑4中任一项所述的方法，其中所述去除所述
Wnt
激活剂在8至
36
小时的范围内进行
。6.
根据权利要求1‑5中任一项所述的方法，还包括在包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体出现后，向所述培养基中添加至少一种
Nodal
抑制剂
。7.
根据权利要求1‑6中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分的量在1％至
15
％
vol/vol
的范围内
。8.
根据权利要求1‑7中任一项所述的方法，还包括在步骤
(d)
中添加选自由以下组成的组的至少一种化合物：
Wnt
激活剂和
BMP
抑制剂
。9.
根据权利要求1‑8中任一项所述的方法，还包括在所述获得多于一个体节后去除细胞外基质或其组分
。10.
一种用于产生肌源性祖细胞的方法，所述方法包括：
(a)
将胚胎干细胞在培养基中繁殖以获得球形聚集体；
(b)
向所述培养基中添加至少一种
Wnt
激活剂以获得包含中胚层细胞和内胚层细胞的聚集体；
(c)
去除所述
Wnt
激活剂；
(d)
观察包含中胚层细胞和内胚层细胞的所述聚集体的形态，并且在所述聚集体具有卵样形态时，添加细胞外基质或其组分，以获得包含轴旁中胚层的聚集体；
(e)
将步骤
(d)
的聚集体孵育
10
至
48
小时，从而获得包含多于一个体节的聚集体；以及
(f)
向步骤
(e)
中的培养基中添加低于
30ng/ml
浓度的一种或更多种生长因子，从而产生肌源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊夫塔赫，
申请(专利权)人：特拉维夫大学拉莫特有限公司，
类型：发明
国别省市：