人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法技术

本申请涉及一种人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法，该方法包括通过目视法观察符合预设条件的人多潜能干细胞克隆，并进行拍照和标记，得到待挑取克隆；通过

【技术实现步骤摘要】
人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法


[0001]本申请涉及干细胞与再生医学领域，尤其涉及一种人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法
。

技术介绍

[0002]多潜能干细胞具有无限增殖能力，可以分化产生机体所有类型的功能细胞，是一种非常理想的“种子”细胞，人多潜能干细胞在细胞治疗
、
药物筛选和疾病模型等研究领域具有广阔的应用前景，其应用有望带来一场新的医学革命
。
[0003]在早期研究阶段，人多潜能干细胞的培养非常具有挑战性，需要通过物理机械操作进行传代，操作步骤复杂
、
工作效率低
。
尽管使用胰蛋白酶或胶原酶可以将人多潜能干细胞消化为单细胞，但是会导致细胞活率降低
、
出现核型异常或自发分化
。
后续的研究发现，使用中性蛋白酶（
dispase
）或细胞消化液（
accutase
），尤其是与
ROCK
抑制剂组合使用时，可以显著提升人多潜能干细胞的存活率
。
此外，一些非酶类的消化液被广泛使用，包括基于
EDTA
改造的细胞解离溶液和
ReLeSR
等产品
。
需要强调的是，非酶类的消化液通常更类似于物理机械操作传代，即将细胞解离成只有几颗细胞的团块进行传代
。
而酶类消化方法，如细胞消化液（
Accutase
）或胰蛋白酶（
TrypLE
），可以将人多潜能干细胞消化成单细胞进行传代
。
尽管这些方法使得体外培养人多潜能干细胞更加稳定和简单，但是仍无法满足人多潜能干细胞进行单克隆挑传建株的需求
。
[0004]人多潜能干细胞在体外培养时，呈单层
、
扁平样克隆生长，克隆内的细胞来源于共同的起始细胞
。
通过将单克隆进行挑传
、
扩增，可以获得单一克隆来源的细胞株，细胞株内的细胞具有良好的均质性，更有利于临床应用和基础科学研究
。
目前挑取单克隆的方法主要是物理机械法，即在显微镜下使用玻璃针将克隆机械地划开，然后将划开的细胞团接种到饲养层细胞进行后续的扩增培养
。
该方法对操作人员有较高的技术要求，操作步骤复杂，工作效率低，团块大小难以均一化，且细胞团块容易飘起导致挑传克隆存在交叉“污染”的风险
。
此外，需要饲养层细胞的支持，会带来安全性的风险
。
事实证明，当需要挑传大于
50
个单细胞克隆时，例如在细胞进行基因修饰时，采用物理机械挑传的方法非常耗费人力并且效率低下
。
[0005]因此，提供一种高效
、
快速且简单的人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法，解决细胞团块飘起造成的挑传克隆交叉“污染”问题，推动人多潜能干细胞在临床应用和基础科学研究的发展，是目前亟待解决的问题
。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本申请提出了一种人多潜能干细胞的单克隆挑传建株方法，以解决上述问题
。
[0007]根据本申请的一方面，提供了一种人多潜能干细胞的单克隆挑传建株方法，包括如下步骤：
目视法观察符合预设条件的人多潜能干细胞克隆，进行拍照和标记，得到待挑取克隆；通过
ReLeSR
消化液对所述待挑取克隆消化后，利用预制的人多潜能干细胞传代培养液进行挑传，依次挑取若干单克隆，并分别接种至预先准备的包被有
Laminin 521
蛋白的培养容器中；利用新鲜的所述人多潜能干细胞传代培养液对所述单克隆继续培养，得到单克隆来源的细胞株
。
[0008]在一种可能的实现方式中，所述获取符合预设条件的人多潜能干细胞克隆，拍照和标记后，得到待挑取克隆之后，还包括：利用洗液对所述待挑取克隆进行清洗，洗去细胞碎片和死细胞
。
[0009]在一种可能的实现方式中，所述人多潜能干细胞传代培养液的配方如下：在一种可能的实现方式中，在预先准备包被有
Laminin 521
蛋白的培养容器时，包括：获取
Laminin 521
蛋白并解冻；利用含钙
、
镁的杜氏磷酸盐缓冲液（
D
ꢀ‑
becco'sphosphate
‑
bufferedsaline
）按预设比例稀释解冻后的所述
Laminin 521
蛋白；将稀释后的所述
Laminin 521
蛋白置于培养容器中，在预设包被条件下包被处理
。
[0010]在一种可能的实现方式中，所述通过
ReLeSR
消化液对所述待挑取克隆消化，包括：室温对所述待挑取克隆消化2分钟后，吸去
ReLeSR
消化液，并在
37℃
培养箱继续消化3分钟
。
[0011]在一种可能的实现方式中，所述利用预制的人多潜能干细胞传代培养液进行挑传，包括：利用
20 μ
L
所述人多潜能干细胞传代培养液收集，转移到
500 μ
L
的所述人多潜能干细胞传代培养液中，用
200 μ
L
移液枪吹打分散成小块
。
[0012]在一种可能的实现方式中，所述单克隆的数量包括
10
‑
15
个
。
[0013]在一种可能的实现方式中，所述利用新的所述人多潜能干细胞传代培养液对所述单克隆继续培养，得到单克隆来源的细胞株之前，还包括：将接种有单克隆的所述培养容器置于
37℃
，饱和湿度，
5%
二氧化碳恒温培养箱中继续培养
。
[0014]本申请的有益效果：本申请通过使用
ReleSR
消化液即非酶类消化液解离人多潜能干细胞，在显微镜下逐个吸取解离开的单个克隆，并接种到
Laminin521
蛋白包被的培养容器内，制备单克隆来源的细胞株
。
具体的包括如下步骤：目视法观察符合预设条件的人多潜能干细胞克隆，拍照和标记后，得到待挑取克隆；通过
ReLeSR
消化液对待挑取克隆消化后，利用预制的人多潜能干细胞传代培养液进行挑传，挑取若干单克隆，并接种至预先准备的包被有
Laminin 521
蛋
白的培养容器中；利用新鲜的人多潜能干细胞传代培养液对所述单克隆继续培养，得到单克隆来源的细胞株
。
有效的克服了物理机械挑传单克隆技术存在的问题，操作更加简单，效率更高
。
不仅能够消化获得均一的细胞“团块”，消化完成也无需加培养液重悬细胞，避免细胞团飘起导致挑传克隆之间的交叉“污染”。
进一步的，本申请也无需饲养层细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法，其特征在于，包括如下步骤：目视法观察符合预设条件的人多潜能干细胞克隆，并进行拍照和标记，得到待挑取克隆；通过
ReLeSR
消化液对所述待挑取克隆消化后，利用预制的人多潜能干细胞传代培养液依次进行挑传，挑取若干单克隆，并分别接种至预先准备的包被有
Laminin 521
蛋白的培养容器中；利用新鲜的所述人多潜能干细胞传代培养液对所述单克隆继续培养，得到单克隆来源的细胞株
。2.
根据权利要求1所述的人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法，其特征在于，所述获取符合预设条件的人多潜能干细胞克隆，拍照和标记后，得到待挑取克隆之后，还包括：利用洗液对所述待挑取克隆进行清洗，洗去细胞碎片和死细胞
。3.
根据权利要求1所述的人多潜能干细胞单克隆挑传建株方法，其特征在于，所述人多潜能干细胞传代培养液的配方如下：
。4.
根据权利要求1所述的人多潜能干细胞的单克隆挑传建株方法，其特征在于，在预先准备包被有
Laminin 521
蛋白的培养容器时，包括：获取
Laminin 521
蛋白并解冻；利用含钙
、
镁的
D
ꢀ‑
becco'sphosphate
‑
bufferedsaline
按预设比例稀释解冻后的所述
Laminin 521
蛋白；将稀释后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘蓓，朱家亮，
申请(专利权)人：北京北启生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：