一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法技术

本发明专利技术涉及干细胞基因编辑技术领域，具体涉及一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法。本发明专利技术提供的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法可实现在多能干细胞中进行单步多重基因组编辑，并具有相对较高的编辑效率，不仅极大地简化了基因组编辑的整个过程，从而节省了基因编辑成本和时间，而且减少了干细胞的重复传代、培养和编辑，从而降低了损害基因组完整性的可能性。整性的可能性。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法


[0001]本专利技术涉及干细胞基因编辑
，尤其涉及一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法。

技术介绍

[0002]近年来，CRISPR/Cas技术因其简单性和稳健性已彻底改变了基因编辑领域（Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P. D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L. A.,&Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819
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823.）。然而，在干细胞、尤其是多能干细胞( Pluripotent Stem Cells, PSC)中进行多重基因组编辑由于其效率低而一直面临较大的挑战性，特别是对于大片段敲入的难度更大、效率更低。目前，许多研究人员已经利用病毒，如逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)来提高PSC中目的基因的递送效率（Han, X., et al. (2019). Generation of hypoimmunogenic human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(21), 10441
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10446；Knopp, Y., et al. (2018). Transient Retrovirus
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Based CRISPR/Cas9 All
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in
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One Particles for Efficient, Targeted Gene Knockout. Molecular Therapy. Nucleic Acids, 13, 256；Martin, R. M., et al. (2019). Highly Efficient and Marker
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free Genome Editing of Human Pluripotent Stem Cells by CRISPR
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Cas9 RNP and AAV6 Donor
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Mediated Homologous Recombination. Cell Stem Cell, 24(5), 821
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828.e5；Raguram, A., et al. (2022). Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell, 185(15), 2806
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2827.）。然而，这可能会诱导意想不到的插入性突变和肿瘤发生；此外，病毒的包装体积相当有限。还有研究人员利用小分子来激活HDR修复途径或抑制NHEJ修复途径，以大大提高PSC中的HDR效率（Lin, S., et al. (2014b). Enhanced homology
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directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. ELife, 3, e04766；Riesenberg, S.,&Maricic, T. (2018). Targeting repair pathways with small molecules increases precise genome editing in pluripotent stem cells. Nature Communications, 9(1)；Zhang, W., et al. (2020). A high
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throughput small molecule screen identifies farrerol as a potentiator of CRISPR/Cas9
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mediated genome editing. ELife, 9, 1
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25.）。然而，这些小分子的功效仍然存在争议。因此，开发不依赖于病毒和小分子增效剂的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法具有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法。
[0004]为解决干细胞中难以实现跨不同基因座的多重基因组编辑的问题，本专利技术以干细胞为研究对象，通过利用和优化CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法，实现了在干细胞中不
使用病毒和小分子增效剂进行跨不同基因座的多重和同步基因组编辑。
[0005]具体地，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，所述方法包括：a）获得核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物，所述核糖核蛋白复合物包含与向导RNA（gRNA）复合的CRISPR/Cas核酸内切酶，所述向导RNA靶向基因组编辑的靶基因；b）将所述核糖核蛋白复合物和供体模板导入干细胞，所述供体模板包含选择标记基因；所述选择标记的种类数m小于多重基因组编辑的靶基因数n，其中，m≥1且为整数，n≥2且为整数。
[0006]本专利技术发现，在人源多能干细胞（hPSC）中，使用多种包含Cas和gRNA表达盒的CRISPR/Cas相关质粒并优化质粒与供体模板的比例等多种编辑条件均无法实现多重基因组编辑，而使用CRISPR/Cas RNP（核糖核蛋白复合物）技术则可显著促进干细胞多重基因组编辑的实现。虽然CRISPR/Cas RNP技术能够提升编辑效率，但是，即便使用CRISPR/Cas RNP技术并优化核转染条件、甚至借助于小分子增效剂仍无法获得多重基因组编辑的阳性克隆。本专利技术意外地发现，与本领域普遍认为的多重基因编辑时针对每个靶基因均分别设置一种选择标记基因不同，在干细胞多重基因组编辑中适当地减少选择标记基因的数量，即将选择标记的数量控制在少于靶基因数的水平，不仅不会影响未设置选择标记基因的靶基因的编辑，反而更有利于提高多重基因编辑的效率，对于实现干细胞的多重基因组编辑具有重要的促进作用。
[0007]对于不设置选择标记基因的靶基因，原则上没有特殊限制，可以为所有靶基因中的任意一个或多个。
[0008]为简化基因编辑，若所进行的多重基因组编辑同时包含基因敲除和敲入，优选针对基因敲除的靶基因不设置选择标记基因，进而可以省去该靶基因的供体模板。
[0009]本专利技术中，多重基因组编辑中靶基因的数量（即基因编辑位点数量）是几个即为几重基因组编辑，例如，靶基因数量为3个，即为三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，其特征在于，所述方法包括：a）获得核糖核蛋白复合物，所述核糖核蛋白复合物包含与向导RNA复合的CRISPR/Cas核酸内切酶，所述向导RNA靶向基因组编辑的靶基因；b）将所述核糖核蛋白复合物和供体模板导入干细胞，所述供体模板包含选择标记基因；所述选择标记的种类数m小于多重基因组编辑的靶基因数n，其中，m≥1且为整数，n≥2且为整数。2.根据权利要求1所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，其特征在于，所述核糖核蛋白复合物的获得包括：分别将各靶基因的向导RNA与CRISPR/Cas核酸内切酶混合孵育制得各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物，再将各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物混合。3.根据权利要求1所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，其特征在于，所述干细胞为多能干细胞；和/或，在干细胞达到40%
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60%汇合度时进行核糖核蛋白复合物和供体模板的导入。4.根据权利要求1~3任一项所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，其特征在于，所述方法还包括：c）利用选择标记进行阳性克隆的筛选；以及，d）去除阳性克隆的选择标记基因。5.根据权利要求4所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，其特征在于，步骤d）中，利用Cre/LoxP重组系统和HSV
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【专利技术属性】
技术研发人员：薛永博，雷莎莎，刘康，时艳，
申请(专利权)人：北赛泓升北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：