使用多顺反子SOX2、KLF4和任选的C-MYC产生诱导多能干细胞制造技术

技术编号:38376352 阅读:12 留言:0更新日期:2023-08-05 17:37
本文中描述了多顺反子表达盒和表达载体,其包含与编码Sox2和Klf4多肽的核酸区段可操作地连接的启动子。所述核酸区段也可以编码c

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多顺反子SOX2、KLF4和任选的C

MYC产生诱导多能干细胞
[0001]本申请要求于2019年10月18日提交的美国临时申请序列No.62/916,830的申请日的优先权权益,其内容通过引用整体明确地并入本文。
[0002]通过引用以Text文件提供的序列表并入
[0003]序列表作为text文件“373038WOSEQ LIST.txt”在此提供,其创建于2020年10月16日,并且大小为53,248字节。text文件的内容通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0004]首次表明分化的体细胞可以重编程成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC),其利用了四种因子的异位表达:Oct4(O)、Sox2(S)、Klf4(K)和c

Myc(M)(Takahashi和Yamanaka,2006)。多年来,Oct4一直被认为在重编程过程中不可或缺,因为其是这四个中唯一一个足以单独诱导多能性,并且其家族成员无法替代其功能(Kim et al.,2009a;Kim et al.,2009b;Nakagawa et al.,2008)。机制研究表明重编程由以下启动:三个先驱因子Oct4、Sox2和Klf4的整体协作接合,随后是全基因组表观遗传重塑和两个转录波(Chen et al.,2016;Chronis et al.,2017;Polo et al.,2012;Smith et al.,2016;Soufi et al.,2012;Sridharan et al.,2009),这些研究强调了Oct4、Sox2和Klf4的协同效应(Chronis et al.,2017;Sridharan et al.,2009),但没有解释为什么Oct4是独特的,并且Sox2和Klf4在这个过程中的功能仍然未被充分认识。
[0005]专利技术概述
[0006]本文中描述了用于通过使用多顺反子盒在细胞重编程期间精确控制因子化学计量的方法和组合物。出人意料地,本文中描述的数据表明,在不存在异位Oct4的情况下、多顺反子Sox2、Klf4和c

Myc(例如,被称为S
2A
K
2A
M多顺反子构建体)足以在数种类型的分化体细胞中建立多能性。在一些情况下,c

Myc是任选的并且使用多顺反子Sox2和Klf4(例如S
2A
K)是足够的。Sox2和Klf4的化学计量对于这种重编程(例如,相比于c

Myc的化学计量)更重要,因为Sox2和Klf4因子平衡的破坏导致iPSC产生显著减少或失效。全基因组研究揭示了Sox2和Klf4的协同结合,导致多能性网络的逐渐激活和建立。此外,用次级S
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K
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M胚胎成纤维细胞(2
°
MEF)和神经祖细胞(2
°
NPC)进行的平行转录组分析表明趋同性重编程轨迹和类似的效率。本文中示出的结果说明了在没有异位Oct4的情况下,Sox2和Klf4在多能性诱导中的化学计量充分性。本文中提供的数据表明了Sox2和Klf4在多能性诱导中的核心功能。
[0007]附图简述
[0008]图1A至1P示出了多顺反子S
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K
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M表达盒(表达Sox2、Klf4和Myc

C,以及在Sox2与Klf4之间以及在Klf4与Myc

C之间的2A可切割接头)将小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)重编程成诱导多能干细胞(iPSC)。图1A示出了描绘S
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K
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M多顺反子表达系统和重编程程序的示意图。图1B示出了从S
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K
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M重编程获得的集落图像,其示出了在重编程第7天集落的EGFP表达(比例尺,100μm)。PH,相位衬度(phase contrast)。MEF表达Oct4

GFP(OG2细胞)作为多能性的标志物,其中Oct4启动子与编码增强型绿色荧光
蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的区段可操作地连接。图1C示出了S
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K
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M集落的图像,其示出了在原位和第1和20代的EGFP信号(比例尺,100μm)。图1D示出了S
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K
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M诱导多能干细胞(iPSC)在Oct4启动子处显示出完全的DNA去甲基化。图1E示出了在S
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K
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M iPSC中检出了Nanog、Sox2和SSEA1蛋白(比例尺,100μm)。图1F图示性地示出了S
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K
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M iPSC中的总体基因表达与R1胚胎干细胞(ESC)的相关性。图1G示出了通过将S
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K
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M iPSC注射到植入假孕雌性体内的囊胚中产生的嵌合小鼠的图像,作为S
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K
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M iPSC是多能性的证实。图1H示出了通过四倍体互补测定建成的小鼠胚胎,该测定涉及对细胞阶段CD1(ICR)胚胎进行电融合以产生四倍体胚胎,并将S
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K
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M iPSC注射到胚胎中以形成重建的四倍体囊胚,将其植入到假孕CD1(ICR)雌性小鼠中。图1I示出了S
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K
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M iPSC有助于植入的囊胚中的生殖细胞。图1J示出了显示用于O
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S
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K
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M、O
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S
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M、O
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K
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M和S
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K
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M的另外的多顺反子盒的示意图,其中O是指Oct4,S是指Sox2,K是指Klf4,并且M是指c

Myc。图1K示出了显示当诱导表达48小时时来自O
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S
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M、O
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K
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M和S
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K
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M表达盒的MEF中的蛋白质表达的western印迹。图1L示出了在长时间暴露之后显示出多顺反子多肽在转导的MEF中的2A位点处的有效切割的western印迹。图1M

1至1M

4图示性地示出了在100,000个起始OG2 MEF中O
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S
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K
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M、O
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S
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M、O
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K
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M和S
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K
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多顺反子表达盒,其包含与核酸区段可操作地连接的启动子,所述核酸区段编码与Klf4多肽同框的Sox2多肽和任选的与之同框的c

Myc多肽,作为单个连续开放阅读框。2.权利要求1所述的多顺反子表达盒,其中所述核酸区段编码Sox2多肽、Klf4多肽和c

Myc多肽。3.权利要求1所述的多顺反子表达盒,其中所述核酸区段还编码在所述Sox2多肽与所述Klf4多肽之间的一个或更多个可切割肽接头。4.权利要求1所述的多顺反子表达盒,其中所述核酸区段还编码将c

Myc多肽编码区与所述开放阅读框邻接的可切割肽接头。5.权利要求1所述的多顺反子表达盒,其中所述启动子与编码所述Sox2多肽和所述Klf4多肽的核酸区段异源。6.权利要求1所述的多顺反子表达盒,其中所述启动子是诱导型启动子。7.权利要求1所述的多顺反子表达盒,其在载体内。8.权利要求7所述的多顺反子表达盒,其中所述载体是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、AIDS病毒载体、神经元营养性病毒载体或辛德毕斯病毒载体。9.宿主细胞,其包含多顺反子表达盒,所述多顺反子表达盒包含与核酸区段可操作地连接的启动子,所述核酸区段编码与Klf4多肽同框的Sox2多肽并任选地编码与之同框的c

Myc多肽,作为单个连续开放阅读框。10.权利要求9所述的宿主细胞,其中所述多顺反子表达盒在载体内。11.权利要求9所述的宿主细胞,其中所述多顺反子表达盒被整合到宿主细胞基因组中。12...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘鹏丁胜
申请(专利权)人:北赛泓升北京生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:

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