一种生物鼓膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及组织工程技术领域，具体涉及一种生物鼓膜及其制备方法和应用。本发明专利技术的生物鼓膜的制备方法以软骨组织为原料，包括先将软骨组织处理为50

【技术实现步骤摘要】
一种生物鼓膜及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及组织工程
，尤其涉及一种生物鼓膜及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鼓膜也称耳膜，是一种弹性灰白色半透明薄膜，将外耳道与中耳隔开。鼓膜由三层结构组成，外层为上皮层，与外耳道皮肤相延续；中间层为纤维层，由主要为Ⅱ型胶原的胶原原纤维（fibril）形成的结缔组织组成，构成了以复杂方式排列的纤维束（Ross M.H.et al.Istologia，Testo eatlante con elementi di Biologia cellulare and molecolare，Ambrosiana Publishing House，2010）；内层为粘膜上皮层，与鼓室粘膜上皮相延续。
[0003]鼓膜穿孔是耳科常见症状，多由慢性化脓性中耳炎或耳外伤所致。慢性鼓膜穿孔会导致听力下降、反复中耳感染和胆脂瘤。慢性化脓性中耳炎引起的鼓膜穿孔甚至会导致严重的颅内外并发症。
[0004]在组织学方面，鼓膜穿孔是由于上皮层的生长速度超过纤维层，越过纤维层与粘膜层相连，形成永久性穿孔，因此需要手术干预恢复鼓膜功能。目前治疗鼓膜慢性穿孔的方法通常是实施鼓膜修补手术，运用各种自体组织（包括颞肌筋膜、软骨、脂肪、软骨膜）或其他来源（同种异体或异种来源）的组织来修补穿孔鼓膜。尽管这些材料对于鼓膜修复具有一定效果，但都有其局限性：首先，自体移植会损伤自身组织，并且在二次手术时取材受限；另一方面，同种异体移植物和异种移植物具有潜在的感染风险；更重要的是，这些移植物均无法复制出原始鼓膜复杂的精细结构和声学振动特性。
[0005]理想的鼓膜修复材料应具备以下特点：
①
良好的生物相容性，低免疫原性；
②
能够促进上皮细胞、纤维细胞黏附、增殖；
③
随着天然鼓膜生长逐渐降解的特性。
[0006]专利申请CN105233343A公开了脱细胞真皮基质鼓膜及外耳组织修复材料的制备方法，CN110448730A公开了一种用于鼓膜修复的生物补片及其制备方法，但是，两者制得的修复材料的主要成分为以Ⅰ型胶原蛋白为主的脱细胞基质，与实际鼓膜中间纤维层（主要为Ⅱ型胶原蛋白）存在较大差异，很难达到鼓膜中间纤维层的再生修复。CN101879098A公开了使用丝蛋白的人工鼓膜及其制造方法，其制得的人工鼓膜虽然可以降解，也可以复合一些生物活性物质，但是缺少天然细胞外基质（ECM）三维结构和其中的有效活性成分胶原蛋白、sGAG等，很难有效达到对损伤鼓膜在结构上的修复和功能上的恢复。
[0007]目前尚缺乏具有天然ECM三维结构以及天然鼓膜中间纤维层有效活性成分II型胶原蛋白和sGAG，且具有低免疫原性和适宜空间结构以及降解特性的鼓膜修复材料。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供一种生物鼓膜及其制备方法和应用。
[0009]现有技术中的鼓膜修复材料大多仅能实现损伤鼓膜的机械修补，较难实现促进、支持鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化的三维结构和活性成分；鼓膜修复材料植入
后，天然鼓膜的再生通常需要一定时间，目前已公开的鼓膜修复材料在植入后降解速率较快，无法达到鼓膜中间层纤维完全修复的需求。
[0010]本专利技术在开发用于鼓膜修复的生物鼓膜材料的过程中发现，生物鼓膜材料不仅需要为鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化提供空间结构和活性成分，还需要满足植入的生物鼓膜材料的降解速率与天然鼓膜的再生速率相适应，已公开的脱细胞基质较难满足上述需求。经不断研发，本专利技术以软骨组织为原料，在对软骨组织进行脱细胞处理的过程中引入特定的交联步骤，能够显著减缓生物鼓膜的降解，更好地适应天然鼓膜的再生过程，同时还能够保证提供适宜鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化的空间结构和活性分子。
[0011]具体地，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种生物鼓膜的制备方法，所述方法以软骨组织为原料，包括先将软骨组织处理为50
‑
500μm的软骨膜片，再将软骨膜片进行交联、脱细胞和去除免疫原的步骤；所述交联包括将软骨膜片依次经EDC
‑
NHS交联和BDDE交联的步骤。
[0012]本专利技术发现，与其他交联方法相比，采用EDC
‑
NHS交联与BDDE交联的组合能够显著减缓生物鼓膜的降解，促进天然鼓膜再生与生物鼓膜降解实现动态平衡，且不会对脱细胞处理产生不利影响，同时保证较高的Ⅱ型胶原蛋白、sGAG等活性成分含量，显著促进鼓膜中间层纤维细胞的黏附、增殖、分化。
[0013]本专利技术中所述的EDC的化学名称为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳化二亚胺，NHS的化学名称为N
‑
羟基琥珀酰亚胺，BDDE的化学名称为丁二醇二缩水甘油基醚。
[0014]上述交联具体为将软骨膜片置于EDC
‑
NHS溶液或BDDE溶液中浸泡处理，实现软骨膜片中成分的交联。
[0015]此外，本专利技术还发现，与在脱细胞处理后进行交联相比，在对软骨膜片进行脱细胞处理前引入交联步骤，能够有效减少Ⅱ型胶原、sGAG等活性物质流失，同时能够稳定生物鼓膜三维空间结构，极大地增加生物鼓膜的力学性能。
[0016]以上所述的EDC
‑
NHS交联体系中，EDC的浓度为20
‑
200mM，NHS的浓度为10
‑
100mM。
[0017]优选地，EDC
‑
NHS交联体系中，EDC的浓度为20
‑
60mM，NHS的浓度为10
‑
30mM。
[0018]优选地，所述EDC
‑
NHS交联在MES缓冲液中进行。
[0019]优选地，EDC
‑
NHS交联体系中，MES缓冲液的浓度为10
‑
1000mM。
[0020]进一步优选地，EDC
‑
NHS交联体系中，MES缓冲液的浓度为20
‑
50mM。
[0021]以上所述的BDDE交联体系中，BDDE的浓度为0.05
‑
0.5%。
[0022]优选地，所述BDDE交联体系中，BDDE的浓度为0.1
‑
0.4%。
[0023]上述方法中，EDC
‑
NHS交联和BDDE交联均为在2
‑
10℃条件下浸泡2
‑
6h（优选3
‑
5h）。
[0024]上述交联的具体条件参数为本专利技术根据软骨组织的特性以及生物鼓膜对于降解速率和空间结构等特性的要求设计，采用上述交联方法能够有效降低生物鼓膜的降解速率，在天然鼓膜的再生过程中，生物鼓膜缓慢降解，能够更好地为天然鼓膜的再生提供空间结构和活性成分，同时不会对脱细胞处理产生不利影响。
[0025]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物鼓膜的制备方法，其特征在于，所述方法以软骨组织为原料，包括先将软骨组织处理为50
‑
500μm的软骨膜片，再将软骨膜片进行交联、脱细胞和去除免疫原的步骤；所述交联包括将软骨膜片依次经EDC
‑
NHS交联和BDDE交联的步骤。2.根据权利要求1所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，EDC
‑
NHS交联体系中，EDC的浓度为20
‑
200mM，NHS的浓度为10
‑
100mM。3.根据权利要求2所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，所述EDC
‑
NHS交联在MES缓冲液中进行；EDC
‑
NHS交联体系中，MES缓冲液的浓度为10
‑
1000mM。4.根据权利要求1~3任一项所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，BDDE交联体系中，BDDE的浓度为0.05
‑
0.5%。5.根据权利要求4所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，EDC
‑
NHS交联和BDDE交联均为在2
‑
10℃条件下浸泡2
‑
6h。6.根据权利要求1~3任一项所述的生物鼓膜的制备方法，其特征在于，在EDC
‑
NHS交联前，先将软骨膜片于蛋白酶抑制剂溶液中浸泡处理；和/或，所述脱细胞为将交联后的软骨膜片于含Triton X
‑
100和/或SDS以及蛋白酶抑制剂的缓冲液中浸泡处理；和/或，所述去除免疫原为将脱细胞后的软骨膜片于含DNase的缓冲液或者含DNase和RNas...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，张召辉，张看，时艳，刘康，赵媛媛，
申请(专利权)人：北赛泓升北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：