用于过继免疫治疗的耐免疫抑制剂的T细胞制造技术

本发明专利技术属于细胞治疗领域，特别是过继T细胞或NK细胞治疗。提供了人亲免素敲除细胞(T细胞或NK细胞)，其中亲免素是FKBP12或亲环蛋白A，或该细胞的细胞群。该细胞对免疫抑制剂耐他克莫司和/或环孢霉素A作用。可通过CRISPR/Cas获得，例如CRISPR/Cas9介导的亲免素敲除或衍生技术。该细胞可为诸如病毒特异性(例如对CMV、EBV、BKV、HPV、ADV、流感病毒或SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于过继免疫治疗的耐免疫抑制剂的T细胞
[0001]本专利技术涉及细胞治疗领域，特别是过继T细胞或NK细胞治疗。它提供了一种通过免疫抑制(特别是钙调磷酸酶抑制剂单独或与皮质类固醇联合)与高度特异性的人类细胞产品结合靶向重塑致病性免疫失衡的概念，所述产品具有单独的亲免素敲除或与类固醇受体敲除结合。因此，本专利技术提供了T细胞或NK细胞，其中亲免素是FK506结合蛋白12(FKBP12)或亲环蛋白A，或这种细胞的细胞亚群或群体。编码亲环蛋白A的基因通常被称为PPIA，肽基丙酰异构酶A。细胞对免疫抑制剂他克莫司和/或环孢霉素A的作用具有耐药性。这种亲环蛋白敲除可以与敲除核受体亚家族3C组成员1(NR3C1；编码糖皮质激素受体的基因)相结合。然后，细胞对免疫抑制剂他克莫司和/或环孢霉素A以及任选的免疫抑制剂皮质类固醇(皮质醇、泼尼松龙、甲基强的松龙、地塞米松)产生耐药性。它可通过基因编辑获得，特别是通过基于亲免素的规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)
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Cas基因敲除，例如通过CRISPR
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Cas9。因此，本专利技术提供了一种基于无载体CRISPR
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Cas核糖核蛋白的良好生产规范(GMP)兼容方案，该方案有效靶向并防止产生他克莫司免疫抑制功能所需的功能性接头蛋白FKBP12、或环孢霉素A免疫抑制功能必需的亲环蛋白A、以及任选地，糖皮质激素的淋巴毒性功能所需的糖皮质激素受体。所述细胞可以是例如恢复对病毒感染保护的病毒特异性细胞，例如对来自CMV、EBV、BKV、HPV、ADV、流感病毒或SARS<br/>‑
CoV
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2中任一种的抗原具有特异性的细胞。它也可能是肿瘤抗原特异性效应细胞，其靶向癌细胞。它也可能是一种调节性T细胞，该细胞是一种防止压倒性免疫/炎症的特殊细胞类型。本专利技术还提供一种制备本专利技术的人亲免素敲除T细胞或NK细胞的方法、包含所述细胞的药物组合物或试剂盒、用于治疗或预防病毒或其他病原体感染或用于治疗癌症或用于平衡不需要的免疫应答(例如，在选自包括自身免疫、过敏、移植和旁观者激活的情况下)。还公开了治疗方法。
[0002]病毒性疾病通常与诸如实体器官移植(SOT)受体中的同种异体器官排斥反应或急性病毒感染期间由标准T细胞激活引起的急性T细胞免疫病理学等不需要的免疫反应有关。诸如巨细胞病毒(CMV)、EB病毒和BK病毒的病毒感染，仍然是慢性免疫功能低下患者发病率和死亡率的主要问题。一个典型的病例是巨细胞病毒(CMV)疾病，这是一种危及生命的并发症，由于在实体器官移植(SOT)受体中预防器官排斥所需的免疫抑制药物而发生。CMV疾病导致直接和间接的疾病，包括移植器官的排斥反应1或肾移植中的慢性同种异体肾病(KTx)2。经典的抗病毒药物被用作阻断性(prophylaxis)、预防性或抢救性治疗，但谨慎用药对预防毒性和耐药性至关重要3。然而，与未感染的受体相比，CMV感染的KTx受体中晚发CMV疾病的发病率较高，死亡率增加4。T细胞介导的抗CMV应答已被证明是CMV疾病结果的一个合适的预测和分层标志物
5,6
。因此，通过过继性抗病毒T细胞治疗来重新产生内源性T细胞反应可以降低移植后CMV相关的发病率和死亡率。
[0003]抗病毒T细胞治疗是重建造血干细胞移植(HSCT)受体有效免疫的一种既定方法7‑
12
。本专利技术人先前已经证实，免疫抑制的实体器官移植受体可以成功产生抗病毒T细胞产品(TCP)
13,14
。在一些研究中报道了采用过继性T细胞转移至实体器官移植受体治疗CMV疾病
15
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。然而，尽管最初有效地减少了症状和病毒载量
18,19
，但TCP的持续性和寿命有限，是成功的CMV疾病过继细胞治疗的主要挑战。同样，在TCP治疗的SOT患者中，爱泼斯坦
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巴尔病
毒载量再次下降
20
。
[0004]抗病毒T细胞治疗长期疗效有限的一个原因可能是实体器官移植受者预防器官排斥所需的持续免疫抑制。KTx(和其他实体器官移植患者)的常规免疫抑制可能包括三类免疫抑制剂中的至少一种：钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI，例如他克莫司[FK506]和环孢霉素A[CsA])可有效降低T细胞激活、成熟和细胞因子分泌
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。糖皮质激素抑制T细胞产生细胞因子
22
，并引发淋巴细胞凋亡
23
。增殖抑制剂霉酚酸(MPA)也可抑制促炎细胞因子的产生
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，可诱导淋巴细胞凋亡并减少T细胞归巢
25
。预形成的同种抗原反应性效应T细胞在移植受体中特别难以控制。
[0005]钙调磷酸酶抑制剂目前是持续抑制这些同种抗原反应细胞的最有效的治疗方法。因此，需要解决方案来维持对同种异体反应性T细胞的控制，同时克服对保护性抗病毒T细胞反应的抑制。为了证明他克莫司对过继转移的病毒特异性TCP的影响，已使用逆转录病毒将他克莫司非敏感形式的钙调磷酸酶引入细胞
26,27
。另一种诱导他克莫司不敏感的方法是使用逆转录病毒整合的siRNA表达盒来敲除亲免素FKBP12
28
，该亲免素是T细胞中免疫抑制功能所需的接头蛋白
29
。然而，逆转录病毒随机地整合到基因组中，因此由于潜在的基因破坏或失调，可能存在安全风险。此外，引入的突变蛋白被认为具有免疫原性。更重要的是，RNA干扰通常是不完全的，因此可能会保持对他克莫司的部分敏感性。这两种方法都尚未达到临床应用。
[0006]严重或慢性病毒性疾病也会由于诸如独立于其T细胞受体特异性的高度分化记忆性T细胞的旁观者激活(例如通过IL
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15)而引起T细胞免疫病理学，尤其是在具有高度分化的T细胞的老年人群中。
[0007]鉴于此，本专利技术人已经解决了提供一种改进的T细胞或NK细胞的问题，该T细胞或NK细胞可用于过继转移到患者的细胞产品中，例如，在不需要的免疫应答被钙调磷酸酶抑制剂抑制的患者中。其目的是在患者接受免疫抑制化疗以限制病理免疫反应的同时，使特定的T细胞对其目标充分反应。
[0008]本专利技术提供一种人亲免素敲除细胞，其为T细胞或NK细胞，其中所述亲免素为FKBP12或亲环蛋白A。亲环蛋白通常被称为肽基脯氨酰异构酶或PPIA。该基因通常被称为PPIA。这些术语在本文中可互换使用。在本专利技术的上下文中，敲除细胞不包含敲除的亲免素基因的功能等位基因。这使细胞对能够与所述亲免素相互作用的免疫抑制剂(即钙调磷酸酶抑制剂)产生耐药性。特别是，如果亲免素是FKBP
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12，则细胞对他克莫司具有耐药性。如果亲免素是亲环蛋白A，则细胞对环孢菌素A(CsA)具有耐药性。
[0009]因此，本专利技术提供了一种靶向FKBP12或PPIA基因的符合GMP的、无载体的基因编辑方法，以制备CMV特异性耐他克莫司或环孢霉素T细胞。通过转染包含CRISPR相关蛋白(Cas)的核糖核蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种人亲免素敲除细胞，所述敲除细胞为T细胞或NK细胞，其中所述亲免素是FKBP12或亲环蛋白A。2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述亲免素是FKBP
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12。3.根据权利要求1所述的细胞，其中所述亲免素是亲环蛋白A。4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞是选自包含病毒、另一病原体或癌症抗原特异性T细胞的T细胞，优选为病毒特异性T细胞，其中所述病毒选自CMV、EBV、BKV、HPV、ADV、流感病毒、细小病毒、风疹病毒、肝炎病毒(HBV、HCV、HAV、HDV、HEV)、柯萨奇病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、诸如但不限于MERS、SARS
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CoV
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1和SARS
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CoV
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2的冠状病毒，。5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述细胞是SARS
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CoV
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2特异性T细胞。6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞通过来自病毒、另一病原体或癌症抗原的抗原刺激以抗原特异性方式启动。7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞是调节性T细胞，优选CD4
+
CD25+调节性T淋巴细胞，其中任选地，所述抗原是自身抗原或同种异体抗原。8.根据权利要求1
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3中任一项所述的细胞，其中所述细胞是NKT细胞、NK细胞或γδT细胞，优选NKT细胞。9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞可通过亲免素基因的CRISPR/Cas介导的基因编辑获得。10.包含权利要求1
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9中任一项所述细胞的细胞群体，其中所述群体是细胞的多克隆群体，其中优选地，所述群体包括在编码亲免素的基因中具有InDel突变的细胞，其中，任选地，所述细胞群体可通过对从人类受试者获得的相应细胞群体的亲免素基因的基因编辑获得，例如通过Cas介导的基因编辑。11.一种制备权利要求1
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9中任一项的人亲免素敲除T细胞或NK细胞或权利要求10的T细胞或NK
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细胞群体的方法，包括a)刺激从受试者获得的T细胞或NK细胞，b)基于标志物的表达分离刺激的T细胞或NK细胞，获得选择的T细胞或NK细胞的组合物，c)基因编辑所述组合物的细胞以敲除编码亲免素的基因，优选地，将包含CRISPR相关蛋白(Cas)和靶向编码亲免素的基因的引导RNA的核糖核蛋白复合物引入所述组合物中的细胞，以及d)任选地，通过在能够与亲免素相互作用的免疫抑制剂的存在下培养所述细胞来选择亲免素敲除细胞，其中，优选地，所述细胞是T细胞。12.根据权利要求11所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书四九页序列表八页附图二六页，
申请(专利权)人：柏林夏瑞蒂医科大学，
类型：发明
国别省市：