【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA支架
[0001]本专利技术涉及用于CRISPR系统的RNA支架。
技术介绍
[0002]CRISPR
‑
Cas技术正在快速发展，并且CRISPR应用的范围持续延伸(Lau,The CRISPR Journal,Vol 1,No 6)。CRISPR系统的关键组分是形成RNA支架的一部分的向导RNA(gRNA)，其首先将CRISPR系统靶向至基因组中的期望靶标，然后将生物活性效应子递送至靶标以执行期望的功能。RNA支架必须以正确的取向和空间构象精确地递送效应子，从而能够以特定方式有效地执行所述功能，以产生期望的结果而不引起脱靶效果。因此，精确基因组靶向效应子系统需要优化的RNA支架。
[0003]本专利技术人已经设计了用于增强的靶向性能的优化RNA支架。本文提供的RNA支架、系统和方法使得能够对基因组进行精确的修饰，同时最小化脱靶效应的可能性，使得该方法和系统特别适用于治疗应用。
技术实现思路
[0004]在第一方面中，本专利技术提供了一种RNA支架，其包含：
[0005](a)tracrRNA；和
[0006](b)具有延伸序列的RNA基序。
[0007]在一个实施方式中，根据第一方面的RNA支架还包含含有向导RNA序列的crRNA。根据第一方面的RNA支架包括一个或多个修饰。RNA基序通过接头连接到tracrRNA的3
’
末端。在优选的实施方式中，接头是单链RNA或化学连接。单链RNA接头包含0
‑
10个核苷酸，优选2>‑
6个核苷酸。
[0008]在一个实施方式中，根据第一方面的RNA支架包含tracrRNA，所述tracrRNA与含有向导RNA序列的crRNA融合，形成单个RNA分子。在其他实施方式中，根据第一方面的RNA支架包含作为分开的RNA分子合成的tracrRNA和含有向导RNA序列的crRNA。在任何实施方式中，tracrRNA通过重复：反重复区域与crRNA杂交。当被合成为如图10B所示的单个RNA分子时，tracrRNA包括反重复区、四环和gRNA的3'恒定区。当合成为分开的RNA分子时，tracrRNA包含反重复区和sgRNA的3'恒定区，并且如图10D所示的不存在四环。tracrRNA的反重复区域与crRNA的重复区域杂交。在优选的实施方式中，重复：反重复区域是延伸的。
[0009]本专利技术的RNA支架包含一个或多个RNA基序，其中所述一个或多个RNA基序包含一个或多个修饰。所述一个或多个修饰可以在所述一个或多个RNA基序的5
’
末端和/或3
’
末端。本专利技术的RNA支架可包括一个或多个修饰，包括在10位的A碱基被取代为2
‑
氨基嘌呤(2AP)。RNA支架可以使用2
’
脱氧
‑2‑
氨基嘌呤或2
’
核糖2
‑
氨基嘌呤。本专利技术的RNA支架可以具有对RNA支架的主链和/或糖部分的一个或多个修饰。RNA基序的延伸序列是双链延伸，其中RNA基序的延伸序列包含2
‑
24个核苷酸。在一个实施方式中，4个核苷酸延伸产生总长度为23个核苷酸的茎(stem)。在另一个实施方式中，10个核苷酸延伸产生总长度为29个核苷酸的茎。在另一个实施方式中，16个核苷酸延伸产生总长度为35个核苷酸的茎。在另一个实
施方式中，26个核苷酸延伸产生总长度为45个核苷酸的茎。
[0010]本专利技术的RNA支架包含与适体结合分子结合的一个或多个RNA基序。一个或多个RNA基序选自以下适体：MS2、Ku、PP7、SfMu和Sm7。例如，MS2适体与MCP蛋白质结合。在优选的实施方式中，RNA支架包含一个募集MS2 RNA基序。在其他实施方式中，RNA支架包括两个募集MS2 RNA基序。在优选的实施方式中，所述MS2适体是野生型MS2、突变型MS2或其变体。本文使用的突变型MS2是C
‑
5、F
‑
5杂合体和/或F
‑
5突变体。根据本专利技术的RNA支架的RNA基序募集效应子模块。如本文所公开的效应子模块包含能够结合至RNA基序的RNA结合结构域和效应子结构域。合适的效应子结构域选自：报告子、标签、分子、蛋白质、微粒和纳米颗粒。在优选实施方式中，效应子结构域是DNA修饰酶。合适的DNA修饰酶选自：AID、CDA、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F或其他APOBEC家族酶、ADA、ADAR家族酶或tRNA腺苷脱氨酶。
[0011]在第二方面，本专利技术提供了一种用于遗传修饰的系统，其包括：
[0012](a)CRISPR蛋白；
[0013](b)如上所定义的本专利技术的crRNA；
[0014](c)如上所述的本专利技术的RNA支架；
[0015](d)适体结合分子；
[0016](e)效应子模块；
[0017]根据第二方面的系统包括以核酸、蛋白质复合物的形式递送和/或通过任何合适的表达载体表达的组分(a)
‑
(e)。
[0018]本文提供的系统可以包含与一个或多个尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)抑制剂肽(UGI)融合的CRISPR蛋白质。在优选实施方式中，根据第二方面的系统中使用的CRISPR是2类II型CRISPR蛋白质，例如cas9。根据第二方面的系统中使用的CRISPR蛋白质和/或效应子模块可以包括一个或多个核定位信号(NLS)。CRISPR蛋白质可以是2类Cas蛋白，其为核酸酶空值或具有切口酶活性。
[0019]根据第二方面的系统中使用的效应子模块可以是包括能够与RNA基序结合的RNA结合结构域和效应子结构域的效应子融合蛋白。根据第二方面的系统可以使用RNA基序和效应子模块，包含选自由以下组成的组的RNA结合结构域对：
[0020]端粒酶Ku结合基序和Ku蛋白或其RNA结合部分，
[0021]端粒酶Sm7结合基序和Sm7蛋白或其RNA结合部分，
[0022]MS2噬菌体操纵基因(operator)茎环和MS2衣壳蛋白(MCP)或其RNA结合部分，PP7噬菌体操纵基因茎环和PP7衣壳蛋白(PCP)或其RNA结合部分，
[0023]SfMu噬菌体Com茎环和Com RNA结合蛋白或其RNA结合部分。
[0024]在第三方面，本专利技术提供了一种用于遗传修饰细胞的方法，其中该方法包括将根据第二方面的系统引入细胞和/或在细胞中表达。根据第三方面的方法可以用于遗传修饰细胞，包括但不限于校正基因突变或灭活基因的表达或改变基因的表达水平或改变内含子
‑
外显子剪接。根据第三方面中提供的方法的遗传修饰是点突变，任选地，其中点突变引入过早成熟的终止密码子，破坏起始密码子，破坏剪接位点或校正基因突变。
附图说明
[0025]图1：图1A显示包括三种结构和功能组分的系本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种RNA支架，其包含：(a)tracrRNA；和(b)具有延伸序列的RNA基序。2.根据权利要求1所述的RNA支架，其中，所述支架还包含含有向导RNA序列的crRNA。3.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA支架，其中，所述支架包含一个或多个修饰。4.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA支架，其中，所述RNA基序经由接头连接至所述tracrRNA的3
’
末端。5.根据权利要求4所述的RNA支架，其中，所述接头是单链RNA或化学连接。6.根据前述权利要求中任一项所述的RNA支架，其中，所述tracrRNA与含有向导RNA序列的所述crRNA融合，形成单个RNA分子。7.根据前述权利要求中任一项所述的RNA支架，其中，所述tracrRNA和含有向导RNA序列的所述crRNA作为分开的RNA分子合成。8.根据前述权利要求中任一项所述的RNA支架，其中，所述tracrRNA通过重复
‑
反重复区域与所述crRNA杂交。9.根据前述权利要求中任一项所述的RNA支架，其中，所述重复
‑
反重复区域是延伸的。10.根据权利要求9所述的RNA支架，其中，所述重复
‑
反重复区域包含上部茎，所述上部茎是延伸的，包含20至26个核苷酸的总长度。11.根据权利要求10所述的RNA支架，其中，所述重复：反重复区域上部茎在作为一个单一RNA分子合成时包含22个核苷酸的总长度。12.根据权利要求10所述的RNA支架，其中，所述重复：反重复区域上部茎在作为两个单独的RNA分子合成时包含25个核苷酸的总长度。13.根据前述权利要求中任一项所述的RNA支架，其中，所述RNA支架包含一个或多个RNA基序。14.根据前述权利要求中任一项所述的RNA支架，其中，所述一个或多个RNA基序包含一个或多个修饰。15.根据权利要求14所述的RNA支架，其中，所述一个或多个修饰在所述一个或多个RNA基序的5
’
末端和/或3
’
末端。16.根据权利要求14所述的RNA支架，其中，所述一个或多个修饰是在10位的A碱基被取代为2
‑
氨基嘌呤(2AP)。17.根据权利要求16所述的RNA支架，其中，2
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氨基嘌呤(2AP)是2
’
脱氧
‑2‑
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