扩增子全面富集制造技术

本文提供了用于在靶向区域内全面富集潜在变体的试剂和方法，称为扩增子全面富集(ACE)。所富集的序列变体可以包含单核苷酸多态性(SNP)、单核苷酸变体或小插入和缺失。实施例包含与实时聚合酶链式反应、下一代测序(NGS)和长读长测序整合的程序。(NGS)和长读长测序整合的程序。(NGS)和长读长测序整合的程序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】扩增子全面富集
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求于2020年6月26日提交的美国临时申请号63/044,634的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术是在国立卫生研究院授予的资助号R01CA203964的政府支持下完成的。政府在本专利技术中具有某些权利。
[0005]对序列表的参考
[0006]本申请含有已经以ASCII格式经由EFS
‑
Web递交的序列表并且将此序列表通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年6月8日，名为RICEP0077WO_ST25.txt，大小为11.6千字节。


[0007]本公开一般涉及分子生物学领域。更特别地，它涉及用于在靶向区域内全面富集潜在变体的试剂和方法，称为扩增子全面富集(ACE)。

技术介绍

[0008]具有低变体等位基因分数(VAF)的DNA序列变体的检测对于一系列研究和临床应用至关重要，包含癌症肿瘤活检和血浆无细胞DNA样本中的肿瘤特异性突变的检测。目前用于检测低VAF突变的仪器要么灵敏度有限(例如，10％VAF下的桑格和纳米孔测序)，要么在多重化方面有限(例如，1重数字PCR)或价格昂贵(例如，用唯一分子标识符(UMI)条形码进行深度测序至25000x或更高)。DNA序列变体的选择性富集将提高qPCR、桑格测序和纳米孔测序的灵敏度，同时降低边合成边测序(NGS)的成本。
[0009]先前的变体富集方法，如基于振荡电场(Boreal Genomics)、具有复杂斜坡的PCR(ICE
‑
COLD PCR)、核酸类似物阻断剂(Diacarta)和酶促消化(Name
‑
Pro)，由于这些方法对环境温度和探针序列的高度脆弱性，通常难以针对多重化基因包进行产品化。阻断剂置换扩增法(Nuprobe)允许温度稳健的变体序列富集，但是具有约20个核苷酸(nt)的富集窗口，这使得它难以用于检查长连续外显子中(例如，如TP53和BRCA1等肿瘤抑制基因中)的突变。因此，需要新的变体富集方法，其允许检查长区域中的突变。

技术实现思路

[0010]因此，本文提供了等位基因全面富集(ACE)技术，它允许在至多100nt的长区域中进行多重化变体等位基因富集。
[0011]在一个实施例中，本文提供了组合物，其包括：(a)辅助寡核苷酸，(b)抑制寡核苷酸，其中所述抑制寡核苷酸包括至少20个核苷酸长并且与所述辅助寡核苷酸的子序列反向互补的受保护子序列，其中所述抑制寡核苷酸包括至少7个核苷酸长并且不与所述辅助寡核苷酸反向互补的未受保护子序列，(c)正向引物寡核苷酸，其中所述正向引物寡核苷酸包
括与所述抑制寡核苷酸的子序列具有同一性的至少6个核苷酸长的子序列，和(d)模板依赖性聚合酶。在一些方面中，所述组合物进一步包括聚合酶功能所需的试剂和缓冲液。在一些方面中，所述模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。在一些方面中，所述模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面中，所述模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。
[0012]在一些方面中，所述组合物进一步包括核酸模板分子，其中所述模板分子包括与所述正向引物寡核苷酸的3
′
子序列的反向互补序列具有超过90％的同源性的子序列。在一些方面中，所述模板分子是生物DNA或RNA分子。在一些方面中，所述模板分子获自细胞样本。在一些方面中，所述模板分子获自生物流体。在某些方面中，所述生物流体是血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液或滑液。在一些方面中，所述模板分子获自组织。在某些方面中，所述组织是活检组织或手术切除组织。在一些方面中，所述模板分子是通过RNA分子的逆转录生成的互补DNA分子。在一些方面中，所述RNA分子获自源自人、动物、植物或环境标本的生物RNA样本。在一些方面中，所述模板分子是通过作用于单链DNA模板的DNA聚合酶生成的扩增子DNA分子。在一些方面中，所述模板分子是由单细胞DNA的多重置换扩增生成的扩增子DNA分子。在一些方面中，所述模板分子是生物DNA分子的物理、化学或酶促生成产物。在一些方面中，所述模板分子是片段化过程的产物。在一些方面中，所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。在一些方面中，所述模板分子是亚硫酸氢盐转化反应、APOBEC反应(即载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样反应)、TAPS反应(即TET辅助的吡啶硼烷测序反应)或其它化学或酶促反应的产物，其中胞嘧啶核苷酸基于其甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶核苷酸。
[0013]在一些方面中，所述辅助寡核苷酸包括起始互补序列子序列和靶结合互补序列子序列。在一些方面中，所述辅助寡核苷酸包括DNA。在一些方面中，所述辅助寡核苷酸由DNA组成。在一些方面中，所述辅助寡核苷酸包括非天然寡核苷酸。在一些方面中，所述辅助寡核苷酸的长度在30和500nt、50和500nt、100和500nt、30和400nt、30和300nt、30和200nt、30和100nt、30和75nt以及30和50nt之间。在一些方面中，所述辅助寡核苷酸至少或约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸长。在一些方面中，所述辅助寡核苷酸具有阻止DNA聚合酶延伸的3
′
化学修饰或DNA序列。
[0014]在一些方面中，所述抑制寡核苷酸包括未受保护子序列和受保护子序列。所述受保护子序列由靶结合子序列和起始子序列组成。在一些方面中，所述受保护子序列至少20个核苷酸长，并且与所述辅助寡核苷酸的至少一个子序列反向互补。在一些方面中，所述受保护子序列至少或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸长。在一些方面中，所述受保护子序列的长度在20
‑
500nt、20
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400nt、20
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300nt、20
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200nt、20
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100nt、20
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80nt、20
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60nt、30
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500nt、30
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400nt、30
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300nt、30
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200nt、30
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100nt、30
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60nt、40
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500nt、40
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300nt、40
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200nt、40
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100nt、40
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80nt、50
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300nt、50
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200nt、50
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包括：(a)辅助寡核苷酸，(b)抑制寡核苷酸，其中所述抑制寡核苷酸包括至少20个核苷酸长并且与所述辅助寡核苷酸的子序列反向互补的受保护子序列，其中所述抑制寡核苷酸包括至少7个核苷酸长并且不与所述辅助寡核苷酸反向互补的未受保护子序列，(c)正向引物寡核苷酸，其中所述正向引物寡核苷酸包括与所述抑制寡核苷酸的子序列具有同一性的至少6个核苷酸长的子序列，和(d)模板依赖性聚合酶。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸包括DNA。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸由DNA组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸包括DNA。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸由DNA组成。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸包括非天然寡核苷酸。7.根据权利要求1或6所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸包括非天然寡核苷酸。8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述正向引物寡核苷酸包括DNA。9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述正向引物寡核苷酸由DNA组成。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。11.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是逆转录酶。12.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述正向引物寡核苷酸包括RNA。13.根据权利要求1至7和12中任一项所述的组合物，其中所述正向引物寡核苷酸由RNA组成。14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸的长度在30和500个核苷酸之间。16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸的所述未受保护子序列不与所述辅助寡核苷酸的任何部分反向互补。17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸的长度在30和500个核苷酸之间。18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述正向引物寡核苷酸的长度在6和70个核苷酸之间。19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸具有阻止模板依赖性聚合酶延伸的3
′
化学修饰或DNA序列。20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸具有阻止模板依赖性聚合酶延伸的3
′
化学修饰或DNA序列。21.根据权利要求19或20所述的组合物，其中所述修饰包括双脱氧核苷酸、反向DNA核苷酸、经硫代磷酸酯取代的主链和烷烃或聚乙二醇(PEG)间隔子。22.根据权利要求19或20所述的组合物，其中3
′
端处的所述DNA序列形成至少一个发夹
结构。23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括多个抑制寡核苷酸物种、多个辅助寡核苷酸物种和多个正向引物寡核苷酸物种。24.根据权利要求23所述的组合物，其中每个抑制寡核苷酸物种包括至少20个核苷酸长并且与至少一个相对应的辅助寡核苷酸物种的子序列反向互补的受保护子序列。25.根据权利要求23或24所述的组合物，其中每个正向引物寡核苷酸物种包括与至少一个相对应的抑制寡核苷酸物种的子序列具有同一性的至少6个核苷酸长的子序列。26.根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中所述多个正向引物寡核苷酸物种各自在5
′
端处或附近包括通用正向衔接子子序列。27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其进一步包括核酸模板分子，其中所述模板分子包括与所述正向引物寡核苷酸的3
′
子序列的反向互补序列具有超过90％的同源性的子序列。28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其进一步包括反向引物寡核苷酸，其中所述模板分子包括与所述反向引物寡核苷酸的3
′
子序列具有超过90％的同源性的子序列。29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述反向引物寡核苷酸的长度在10和70个核苷酸之间。30.根据权利要求28至29所述的组合物，其中所述反向引物寡核苷酸在5
′
端处或附近包括通用反向衔接子子序列。31.根据权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述模板分子是生物DNA或RNA分子。32.根据权利要求27至31中任一项所述的组合物，其中所述模板分子获自细胞样本。33.根据权利要求27至31中任一项所述的组合物，其中所述模板分子获自生物流体。34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述生物流体是血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液或滑液。35.根据权利要求27至31中任一项所述的组合物，其中所述模板分子获自组织。36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组织是活检组织或手术切除组织。37.根据权利要求27至36中任一项所述的组合物，其中所述模板分子是通过RNA分子的逆转录生成的互补DNA分子。38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述RNA分子获自源自人、动物、植物或环境标本的生物RNA样本。39.根据权利要求27至36中任一项所述的组合物，其中所述模板分子是通过作用于单链DNA模板的DNA聚合酶生成的扩增子DNA分子。40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述模板分子是由单细胞DNA的多重置换扩增生成的扩增子DNA分子。41.根据权利要求27至36中任一项所述的组合物，其中所述模板分子是生物DNA分子的物理、化学或酶促生成产物。42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述模板分子是片段化过程的产物。43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。
44.根据权利要求41所述的组合物，其中所述模板分子是亚硫酸氢盐转化反应、APOBEC反应、TAPS反应或其它化学或酶促反应的产物，其中胞嘧啶核苷酸基于其甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶核苷酸。45.根据权利要求27至44中任一项所述的组合物，其中所述模板分子包括位于正向引物结合子序列和反向引物同源子序列之间的靶子序列。46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述靶子序列与不包含起始子序列的抑制寡核苷酸受保护子序列的部分的反向互补序列具有至少70％的同一性。47.根据权利要求45或46所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸在所述抑制寡核苷酸的3
′
处或附近具有起始子序列。48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述起始子序列的长度在4和25个核苷酸之间。49.根据权利要求47或48所述的组合物，其中所述起始子序列与紧邻所述靶子序列的3
′
的所述模板分子子序列的反向互补序列具有小于30％的同一性。50.根据权利要求47至49中任一项所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸在所述辅助寡核苷酸的5
′
端处或附近具有起始互补序列子序列。51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述起始互补序列子序列的长度在4和25个核苷酸之间。52.根据权利要求50或51所述的组合物，其中所述起始互补序列子序列与所述抑制寡核苷酸的所述起始子序列的反向互补序列具有至少90％的同一性。53.根据权利要求27至52中任一项所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸不具有与反向互补序列正向引物寡核苷酸具有超过30％的同一性的子序列。54.根据权利要求1至53中任一项所述的组合物，其进一步包括荧光团功能化DNA探针。55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述荧光团功能化DNA探针是Taqman探针或分子信标。56.根据权利要求1至53中任一项所述的组合物，其进一步包括DNA嵌入染料。57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述DNA嵌入染料是SybrGreen、EvaGreen或Syto。58.根据权利要求1至57中任一项所述的组合物，其中所述辅助寡核苷酸与所述抑制寡核苷酸的化学计量比在0.8和100之间。59.根据权利要求1至58中任一项所述的组合物，其中所述正向引物寡核苷酸和所述模板分子在60℃的温度和0.2M钠的盐度下的标准杂交自由能(ΔG
°1)在
‑
7kcal/mol和
‑
20kcal/mol之间。60.根据权利要求1至59中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸和所述模板分子在60℃的温度和0.2M钠的盐度下的标准杂交自由能(ΔG
°2)在
‑
16kcal/mol和
‑
200kcal/mol之间。61.根据权利要求1至60中任一项所述的组合物，其中所述抑制寡核苷酸和所述辅助寡核苷酸在60℃的温度和0.2M钠的盐度下的标准杂交自由能(ΔG
°3)在
‑
15kcal/mol和
‑
200kcal/mol之间。62.根据权利要求60和61中任一项所述的组合物，其中(ΔG
°2‑
ΔG
°3)的值在
‑
5kcal/
mol和+5kcal/mol之间。63.根据权利要求1至62中任一项所述的组合物，其进一步包括聚合酶功能所需的试剂和缓冲液。64.一种用于使用聚合酶链式反应选择性地扩增DNA序列变体的方法，所述方法包括：(a)将可能包括变体DNA模板分子并且可能包括野生型DNA模板分子的样本与以下混合：(i)辅助寡核苷酸，(ii)抑制寡核苷酸，其中所述抑制寡核苷酸包括至少20个核苷酸长并且与所述辅助寡核苷酸的子序列反向互补的受保护子序列，其中所述抑制寡核苷酸包括至少7个核苷酸长并且不与所述辅助寡核苷酸反向互补的未受保护子序列，其中所述受保护子序列包括靶结合子序列和起始子序列，并且其中所述靶结合子序列与所述野生型DNA模板分子的反向互补序列具有至少70％的同一性，(iii)正向引物寡核苷酸，其中所述正向引物寡核苷酸包括与所述抑制寡核苷酸的所述未受保护子序列的至少一部分具有同一性的至少6个核苷酸长的子序列，并且其中所述正向引物寡核苷酸的3
′
子序列的反向互补序列与所述野生型DNA模板具有至少90％的同一性，(iv)反向引物寡核苷酸，其中所述反向引物寡核苷酸的3
′
子序列与所述野生型DNA模板的子序列具有至少90％的同一性，和(v)DNA聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫，
申请(专利权)人：威廉马歇莱思大学，
类型：发明
国别省市：