高效表达人白介素-35细胞株、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术提出一种高效表达人白介素

【技术实现步骤摘要】
高效表达人白介素
‑
35细胞株、其制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物制药
，尤其涉及一种高效表达人白介素
‑
35细胞株、其制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]人白介素35是由α链p35和β链EB病毒诱导基因3(EBI3)通过二硫键组成的异源二聚体，属于IL
‑
12家族，是目前该家族唯一具有免疫抑制作用的细胞因子。它的生物学功能主要包括：(1)抑制T淋巴细胞或B淋巴细胞的增殖；(2)促进Treg细胞的增殖；(3)抑制Th17细胞的极化和IL
‑
17的产生；(4)诱导初始T淋巴细胞或B淋巴细胞转化为分泌IL
‑
35的Treg(IL
‑
35induced regulatory T cell，iTR35)或Breg(IL
‑
35+Breg)。基于IL
‑
35的生物学功能，其在免疫抑制的调节及免疫耐受微环境的形成中可能发挥着重要作用。因此，如何实现人白介素
‑
35天然蛋白分子的高效稳定表达是其开展后续应用的关键。
[0003]但是，基于现有的方法无法实现白介素
‑
35的高效稳定表达，例如，中国专利申请CN106075401A公开了一种IL
‑
35
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Fc融合蛋白以及白介素
‑
35在制备治疗自身免疫性皮肤病药物中的用途，其中，合成的IL
‑
35r/>‑
Fc融合蛋白是通过在IL
‑
35蛋白的C末端链接人的IgG1的Fc所得的新型蛋白，虽然此种方法成功制备了IL
‑
35
‑
Fc融合蛋白，但是这种蛋白属于非人体天然蛋白，其不仅应用范围受限，而且基于该文件公开的方法无法获得稳定表达的白介素
‑
35天然蛋白分子。
[0004]综上，如何获得高效稳定表达的人白介素
‑
35天然蛋白分子是本领域技术人员亟待解决的课题。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术存在的无法实现人白介素
‑
35天然蛋白分子稳定表达的问题，提出一种高效表达人白介素
‑
35细胞株、其制备方法及其应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]高效表达人白介素
‑
35细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0008]通过质粒系统筛选步骤，筛选出作为制备所述高效表达人白介素
‑
35细胞株的双质粒系统；
[0009]通过比较CHO
‑
K1
‑
IL
‑
35重组细胞与CHO
‑
DG44重组细胞的白介素
‑
35的表达量，筛选出CHO
‑
K1细胞作为制备高效表达人白介素
‑
35细胞株的CHO细胞株，其中，CHO
‑
K1
‑
IL
‑
35重组细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO
‑
K1
‑
IL
‑
35，其保藏编号为CCTCC No：C202205，分类学命名为中国仓鼠卵巢细胞，于2021年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心；
[0010]通过将带有人白介素
‑
35基因序列的双质粒表达系统瞬时转染至CHO
‑
K1细胞的基因组中，经过筛选试验和生物活性检测，筛选得到高效表达人白介素
‑
35细胞株。
[0011]在一实施方案中，高效表达人白介素
‑
35细胞株的制备方法，包括如下步骤：
[0012]基因序列获取与优化：从NCBI数据库中获取人白介素
‑
35基因p35亚基和EBI3亚基的天然氨基酸序列与天然核苷酸序列，对p35亚基和EBI3亚基的天然核苷酸序列进行优化，得到p35亚基优化序列和EBI3亚基优化序列；
[0013]重组表达质粒构建与细胞转染：将p35亚基天然核苷酸序列、p35亚基优化序列、EBI3亚基天然核苷酸序列和EBI3亚基优化序列分别与含不同的信号肽的核苷酸序列进行组合后分别合成到双质粒系统中，再分别转染至CHO
‑
K1细胞的基因组中，得到四种不同的CHO
‑
K1重组细胞；
[0014]高效表达人白介素
‑
35细胞株筛选：所述四种不同的CHO
‑
K1重组细胞培养一段时间后，比对细胞上清中白介素
‑
35的表达量，再依次经过小库筛选、单克隆筛选以及生物活性检测后，最终筛选出表达量最高的CHO
‑
K1重组细胞即为高效表达人白介素
‑
35细胞株。
[0015]在一实施方案中，所述p35亚基优化序列如SEQ ID NO.14所示，EBI3亚基优化序列如SEQ ID NO.10所示；
[0016]所述含不同的信号肽的核苷酸序列中信号肽包括天然信号肽和鼠源信号肽，其中，含天然信号肽的p35亚基天然核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，含鼠源信号肽的p35亚基优化核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，含天然信号肽的EBI3亚基天然核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，含鼠源信号肽的p35亚基优化核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0017]在一实施方案中，所述重组表达质粒构建与细胞转染步骤中，双质粒系统为pcDNA3.1质粒和pXC17.4质粒，其中，p35亚基的天然核苷酸序列合成到pXC17.4质粒上，EBI3亚基的天然核苷酸序列合成到pcDNA3.1质粒上；
[0018]所述四种不同的CHO
‑
K1重组细胞分别为：带有天然信号肽的p35亚基天然核苷酸序列和EBI3亚基天然核苷酸序列的CHO
‑
K1重组细胞、带有鼠源信号肽的p35亚基天然核苷酸序列和EBI3亚基天然核苷酸序列的CHO
‑
K1重组细胞、带有天然信号肽的p35亚基优化序列和EBI3亚基优化序列的CHO
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K1重组细胞和带有鼠源信号肽的p35亚基优化序列和EBI3亚基优化序列的CHO
‑
K1重组细胞。
[0019]在一实施方案中，所述高效表达人白介素
‑
35细胞株筛选步骤中，加压筛选所用培养基配方为：EmCD CHO medium+(0.5％
‑
5.0％)H/T+(0.1％
‑
2.0％)Anti
‑
clumping Agent+(10μM
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30μM)GS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高效表达人白介素
‑
35细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过质粒系统筛选步骤，筛选出作为制备所述高效表达人白介素
‑
35细胞株的双质粒系统；通过比较CHO
‑
K1
‑
IL
‑
35重组细胞与CHO
‑
DG44重组细胞的白介素
‑
35的表达量，筛选出CHO
‑
K1细胞作为制备高效表达人白介素
‑
35细胞株的CHO细胞株；通过将带有人白介素
‑
35基因序列的双质粒表达系统瞬时转染至CHO
‑
K1细胞的基因组中，经过筛选试验和生物活性检测，筛选得到高效表达人白介素
‑
35细胞株。2.根据权利要求1所述的高效表达人白介素
‑
35细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：基因序列获取与优化：从NCBI数据库中获取人白介素
‑
35基因p35亚基和EBI3亚基的天然氨基酸序列与天然核苷酸序列，对p35亚基和EBI3亚基的天然核苷酸序列进行优化，得到p35亚基优化序列和EBI3亚基优化序列；重组表达质粒构建与细胞转染：将p35亚基天然核苷酸序列、p35亚基优化序列、EBI3亚基天然核苷酸序列和EBI3亚基优化序列分别与含不同的信号肽的核苷酸序列进行组合后分别合成到双质粒系统中，再分别转染至CHO
‑
K1细胞的基因组中，得到四种不同的CHO
‑
K1重组细胞；高效表达人白介素
‑
35细胞株筛选：所述四种不同的CHO
‑
K1重组细胞培养一段时间后，比对细胞上清中白介素
‑
35的表达量，再依次经过小库筛选、单克隆筛选以及生物活性检测后，最终筛选出表达量最高的CHO
‑
K1重组细胞即为高效表达人白介素
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35细胞株。3.根据权利要求2所述的高效表达人白介素
‑
35细胞株的制备方法，其特征在于，所述p35亚基优化序列如SEQ ID NO.14所示，EBI3亚基优化序列如SEQ ID NO.10所示；所述含不同的信号肽的核苷酸序列中信号肽包括天然信号肽和鼠源信号肽，其中，p35亚基天然信号肽的天然核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，p35亚基鼠源信号肽的优化核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，EBI3亚基天然信号肽的天然核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，p35亚基天鼠源信号肽的优化核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。4.根据权利要求3所述的高效表达人白介素
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35细胞株的制备方法，其特征在于，所述重组表达质粒构建与细胞转染步骤中，双质粒系统为pcDNA3.1质粒和pXC17.4质粒，其中，p35亚基的天然核苷酸序列合成到pXC17.4质粒上，EBI3亚基的天然核苷酸序列合成到pcDNA3.1质粒上；所述四种不同的CHO
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K1重组细胞分别为：带有天然信号肽的p35亚基天然核苷酸序列和EBI3亚基天然核苷酸序列的CHO
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K1重组细胞、带有鼠源信号肽的p35亚基天然核苷酸序列和EBI3亚基天然核苷酸序列的CHO
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K1重组细胞、带有天然信号肽的p35亚基优化...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥维，韩倩，王媛媛，张凯跃，王建刚，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：