【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质的等电聚焦电泳等电点检测，具体地说，涉及一种蛋白质等电聚焦电泳等电点的检测方法。
技术介绍
1、等电聚焦电泳法(isoelectric focusing(ief)，also known aselectrofocusing)是两性电解质在电泳场中形成一个ph梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的ph值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当达到其等电点时，电流达到最小，不再移动。从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。其优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02ph单位的蛋白质分开；一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点，很稀的样品也可进行分离；可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01ph单位。ief技术应用广泛可用于蛋白质的定性鉴别，等电点测定、限度检查以及定量测定。
2、《中国药典》0541电泳法介绍了水平板电泳法。然而该方法配胶面积固定，如检测样品少则多数面积被浪费。配制时易出现气泡及聚胶不匀等情况，配胶难度大，成功率低，固定和染色过程中胶易脱模，使用凝胶成像仪拍照时胶易破碎且自配胶品控不稳定会导致每次结果差异较大，同时存在蛋白扩散和拖尾的情况(如图1所示)，需重复实验。耗费了大量的时间、人力及试剂成本。
3、目前，ief电泳常出现以下问题：
4、(1)ief电泳常出现蛋白扩散、条带模糊、
5、(2)配胶操作难度大，成功率低，自配胶在染色及脱色过程中易与膜脱离，多次配胶造成耗材严重浪费且自配胶品控不稳定会导致每次结果差异较大。
6、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种蛋白质等电聚焦电泳等电点的检测方法。本专利技术方法操作简单，重复性好，可分次使用不造成浪费，检测结果不拖尾，蛋白不扩散。
2、为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种蛋白质等电聚焦电泳等电点的检测方法，包括配制泡胶液、泡胶、供试品和对照品处理、电泳、固定及染色、结果扫描及分析，其中，所述的电泳包括预电泳、上样、等电聚焦和条带聚焦，其中所述的等电聚焦在电压800～1500v下维持150～210min；所述的条带聚焦在电压1300～2000v下维持40～90min。
4、进一步地，所述的电泳按如下电泳程序进行：
5、预电泳：电压600～800v，时间15～30min；
6、上样：电压400～600v，时间20～40min；
7、等电聚焦：电压800～1500v，时间150～210min；
8、条带聚焦：电压1300～2000v，时间40～90min。
9、进一步地，所述的供试品和对照品处理包括如下步骤：
10、步骤一、润洗离心管
11、取超滤离心管2支，分别用作对照品管和供试品管，于两管中各加入甘氨酸溶液，离心；
12、步骤二、添加对照品和供试品溶液
13、分别向两离心管中加入对照品和供试品，离心，弃去外管全部液体；
14、步骤三、缓冲液置换
15、再分别向两离心管中加入甘氨酸溶液，离心；
16、步骤四、将蛋白稀释至合适的终浓度
17、吸出内管中全部样品至对应离心管中，向对照品管和供试品管中分别加入甘氨酸溶液，将蛋白稀释至合适的终浓度，得到处理后的对照品和供试品。
18、上述处理过程中，步骤一的目的为润洗离心管，减少离心管对蛋白的吸附。步骤三的目的是为了将溶解蛋白的溶剂pbs置换掉。未进行此操作的情况，简称无置换；重复此操作1～3次，则分别简称为置换一次、置换二次、置换三次，甘氨酸可以换成其它的两性离子洗涤剂，浓度也可以调整，采用1％甘氨酸重复1次操作，描述为1％甘氨酸置换一次。
19、进一步地，处理后的对照品和供试品的终浓度均为0.5～5mg/ml，优选2mg/ml。
20、进一步地，在供试品和对照品处理过程中，所加入的甘氨酸溶液的浓度均为0.1～5％，优选1％。
21、进一步地，在供试品和对照品处理过程中，所述的离心均在4℃、14000rmp下离心20min。
22、进一步地，所述的缓冲液置换1～3次，优选置换1次。
23、进一步地，所述的配制泡胶液为：
24、称取山梨醇，加入两性电解质，再加入灭菌注射用水，临用现配。
25、进一步地，所述的配制泡胶液具体如下：
26、称取山梨醇2.2g，加入ph3-10的两性电解质1640μl，加入灭菌注射用水至22ml，临用现配。
27、本专利技术还提供所述的检测方法在il-10样品等电聚焦电泳等电点检测中的应用。
28、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
29、本专利技术方法操作简单，重复性好，可分次使用不造成浪费，检测结果不拖尾，蛋白不扩散。
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1.一种蛋白质等电聚焦电泳等电点的检测方法，包括配制泡胶液、泡胶、供试品和对照品处理、电泳、固定及染色、结果扫描及分析，其特征在于，所述的电泳包括预电泳、上样、等电聚焦和条带聚焦，其中所述的等电聚焦在电压800～1500V下维持150～210min；所述的条带聚焦在电压1300～2000V下维持40～90min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的电泳按如下电泳程序进行：
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的供试品和对照品处理包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，处理后的对照品和供试品的终浓度均为0.5～5mg/ml，优选2mg/ml。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在供试品和对照品处理过程中，所加入的甘氨酸溶液的浓度均为0.1～5％，优选1％。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在供试品和对照品处理过程中，所述的离心均在4℃、14000rmp下离心20min。
7.根据权利要求4～6任意一项所述的检测方法，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的配制泡胶液为：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的配制泡胶液具体如下：
10.权利要求1～9任意一项所述的检测方法在IL-10蛋白质等电聚焦电泳等电点检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种蛋白质等电聚焦电泳等电点的检测方法，包括配制泡胶液、泡胶、供试品和对照品处理、电泳、固定及染色、结果扫描及分析，其特征在于，所述的电泳包括预电泳、上样、等电聚焦和条带聚焦，其中所述的等电聚焦在电压800～1500v下维持150～210min；所述的条带聚焦在电压1300～2000v下维持40～90min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的电泳按如下电泳程序进行：
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的供试品和对照品处理包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，处理后的对照品和供试品的终浓度均为0.5～5mg/ml，优选2mg/ml。
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽民，张静，王瑞玲，王建刚，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：
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