一种高亲和型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种高亲和型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用；本发明专利技术设计haPD1高亲和型嵌合转换受体转染改造的NK92细胞，其中高亲和型嵌合转换受体包括haPD

【技术实现步骤摘要】
一种高亲和型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高亲和型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肿瘤免疫疗法是继手术、放疗、化疗之后的第四大肿瘤治疗手段，相较于其他形式的肿瘤免疫疗法，过继性细胞疗法具有更多的优势及更好的疗效，在这之中，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR
‑
T）的发展最为迅猛。CAR
‑
T在血液系统恶性肿瘤中效果显著，然而，实体瘤的效果则逊之，并且具有潜在的细胞因子风暴、神经毒性等副作用。此外，由于异源T细胞易引发移植物抗宿主病（graft
‑
versus
‑
host disease，GVHD），所以患者一般只能采用自体T细胞进行CAR修饰后再进行回输，这使临床CAR
‑
T应用步骤繁琐且价格高昂。由于固有免疫系统中的自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）是一种天然抗肿瘤细胞，因此，一些研究人员开始尝试利用CAR结构修饰NK细胞（简称CAR
‑
NK）。
[0003]相较于CAR
‑
T疗法，NK细胞作为效应细胞具有很多优良特性。首先，不会像T细胞一样产生移植物抗宿主反应现象，有望成为通用型细胞治疗手段；其次，NK细胞不受抗原特异性组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制，具有更强的杀伤能力；再次，NK细胞表面CD16低亲和力分子可与靶细胞表面IgG抗体复合物介导ADCC作用；NK细胞也可通过Fas/FasL途径介导细胞凋亡，释放细胞因子。综合以上优点，使用NK细胞改造的嵌合抗原受体NK（CAR
‑
NK）细胞将更有应用前景。
[0004]现有技术中，中国专利CN201911317011.1公开的一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用，其中嵌合抗原受体包括PD
‑
1的胞外结构域片段、F2A肽片段、CD8a信号肽胞外区、识别结合HER2蛋白的单链抗体胞外可变区、CD8αLinker区、CD28跨膜及胞内协同共刺激区、胞内传递信号的CD3ζ片段；这种传统的ｓｃＦｖ因存在于胞外不能正常折叠从而无法正常发挥功能，需要增强亲和性避免此问题发生；另外经过国内外文献证实，采用CD8跨膜域、41BB胞内域和CD28跨膜域、DAP10胞内域的组合均可以增强抗肿瘤效应并提高在体内的存活时间，但需要优选出组合效应更强，且分化为中枢记忆表型的能力更强的重组片段；并且在NK细胞改造的研究过程中，发现NK细胞表面存在众多杀伤抑制受体（KIRs），在肿瘤微环境中可能会被诱导表达，从而抑制免疫细胞的杀伤功能，致使免疫细胞功能衰竭，此种抑制受体被称为免疫抑制检查点，如程序性死亡受体（Programmed Death 1，PD
‑
1）与其配体PD
‑
L1结合可抑制T细胞活化和增殖，下调T细胞免疫刺激性细胞因子的分泌，从而抑制T细胞免疫反应，促使T细胞凋亡；肿瘤细胞可高表达PD
‑
L1，与T细胞表面PD
‑
1结合后，抑制T细胞的杀伤活性，实现免疫逃逸。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于利用合成生物学技术，设计新型靶向PD
‑
L1高亲和型嵌合转换受体，转染改造NK92细胞，并利用haPD
‑
1胞外域靶向识别、结合肿瘤表面的PD
‑
L1配体，通过
CD28跨膜域、DAP10胞内域、CD3ζ胞内域将激活性信号传递、活化及释放，增强NK92细胞抗肿瘤免疫活性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，其为haPD
‑
1高亲和型嵌合转换受体转染改造的NK92细胞；所述haPD1高亲和型嵌合转换受体包括haPD
‑
1胞外段、CD28跨膜段、DAP10胞内段、CD3ζ胞内段。
[0007]具体的，所述的haPD
‑
1胞外段的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。
[0008]具体的，所述的CD28跨膜段的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示。
[0009]具体的，所述的DAP胞内段的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示。
[0010]具体的，所述的CD3ζ胞内段的核苷酸序列如 SEQ ID No.4所示。
[0011]一种高亲和型抗肿瘤NK细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤一：重组慢病毒载体haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ
‑
pCDH的构建；通过全基因合成方法将haPD
‑
1胞外段、CD28跨膜段、DAP胞内段、CD3ζ胞内段串联起来，获得haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ片段；将haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ片段亚克隆在pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
P2A
‑
copGFP
‑
T2A
‑
Puro慢病毒载体上，获得重组慢病毒载体haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ
‑
pCDH；步骤二：慢病毒包装过程；将步骤一获得的重组慢病毒载体haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ
‑
pCDH提取出目的质粒haChR3；再将目的质粒haChR3、慢病毒包装辅助质粒psPAX2、慢病毒包装辅助质粒PMD2.G按照4:3:1的比例混合转染进293T细胞，以产出带有目的质粒的病毒；将转染后收获的病毒上清采用PEG浓缩法进行浓缩；步骤三：慢病毒转染NK92细胞；取浓缩好的带有目的质粒的病毒悬液侵染NK92细胞，可获得稳定表达haChR3
‑
pCDH的NK92细胞株。
[0012]具体的，所述的重组慢病毒载体haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ
‑
pCDH的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0013]具体的，所述的haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6；其氨基酸序列如 SEQ ID No.5。
[0014]通过上述制备方法得到的一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，应用于抗肿瘤细胞药物研究；尤其是，其能够对SGC
‑
7901胃癌细胞进行体外本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，其为haPD
‑
1高亲和型嵌合转换受体转染改造的NK92细胞；所述haPD
‑
1高亲和型嵌合转换受体包括haPD
‑
1胞外段、CD28跨膜段、DAP10胞内段、CD3ζ胞内段。2.根据权利要求1所述的一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述的haPD
‑
1胞外段的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1所述的一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述的CD28跨膜段的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求1所述的一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述的DAP胞内段的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示。5.根据权利要求1所述的一种高亲和型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述的CD3ζ胞内段的核苷酸序列如 SEQ ID No.4所示。6.一种高亲和型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：重组慢病毒载体haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ
‑
pCDH的构建；通过全基因合成方法将haPD
‑
1胞外段、CD28跨膜段、DAP胞内段、CD3ζ胞内段串联起来，获得haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ片段；将haPD1
‑
CD28
‑
DAP10
‑
CD3ζ片段亚克隆在pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
P2A
‑
copGFP
‑
T2A
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：支灵通，高晴，张璇，郭长江，牛志远，朱武凌，李永海，王宇，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：