提高Cas核酸酶靶标特异性制造技术

本发明专利技术涉及一种修饰宿主细胞中的靶标位点的方法，其包括使所述宿主细胞与Cas核酸酶接触，其中还使所述宿主细胞与低亲和力Cas抑制剂和/或亚抑制浓度的Cas抑制剂接触；并且涉及一种用于提高Cas核酸酶的特异性的方法，其包括a)提供Cas核酸酶；b)使所述Cas核酸酶与低亲和力Cas抑制剂或亚抑制浓度的Cas抑制剂接触；和c)从而提高所述Cas酶的特异性。此外，本发明专利技术涉及与之相关的组合物、多肽、用途和方法。多肽、用途和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高Cas核酸酶靶标特异性
[0001]本专利技术涉及一种修饰宿主细胞中的靶标位点的方法，其包括使所述宿主细胞与Cas核酸酶接触，其中还使所述宿主细胞与低亲和力Cas抑制剂和/或亚抑制浓度的Cas抑制剂接触；并且涉及一种用于提高Cas核酸酶的特异性的方法，其包括a)提供Cas核酸酶；b)使所述Cas核酸酶与低亲和力Cas抑制剂或亚抑制浓度的Cas抑制剂接触；和c)从而提高所述Cas酶的特异性。此外，本专利技术涉及与之相关的组合物、多肽、用途和方法。
[0002]CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)
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Cas技术的出现使得详细透彻的基因组研究成为可能并让遗传疾病的靶向治疗前近了一步。Cas核酸酶的保真性，即与表现出与RNA指导部分互补的脱靶(Off
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target)位点相比针对单指导(sg)RNA匹配基因组靶标基因座的选择性，是CRISPR应用要考虑的关键参数。先前的研究采用了定向进化或结构引导的蛋白质工程来鉴定Cas酶中减少脱靶编辑的点突变(例如，Kulcsar et al.，Genome Biol 18：190(2017)，Kleinstiver et al.，Nature 529：490
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495(2016))。互补的尝试为靶标特异性sgRNA的设计设计出了规则(例如，Akcakayaet al.，Nature 561：416
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419(2018))。虽然这些策略总体上强大，但仍通常要求使用者采用特定的CRISPR
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Cas组分。
[0003]抗
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CRISPR(Acr)蛋白最初被鉴定为是天然存在的CRISPR
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Cas抑制剂。其中有AcrIIA4，一种强效的化脓性链球菌(Spy)Cas9抑制剂，它以亚纳摩尔亲和力结合Cas9
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sgRNA复合物并损害DNA靶向以及核酸酶功能(例如，Dong et al.，Nature 546：436
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439(2017))。最近的数据表明，在SpyCas9
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sgRNA递送后不久施用AcrIIA4可减少脱靶编辑(Shin et al，Sci Adv 3，e1701620(2017))。然而，这种策略需要两个单独的、精确定时的递送步骤(一个用于Cas9
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sgRNA，一个用于Acr)并还显著降低在靶(On
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target)编辑效率。
[0004]因此，本领域需要提供可靠的手段来提高Cas核酸酶靶标特异性。特别地，需要提供将至少部分避免上述现有技术缺点的手段和方法。
[0005]该问题通过具有独立权利要求的特征的方法、组合物和用途来解决。在从属权利要求中列出了可以单独的方式或以任何任意组合实现的优选实施方案。
[0006]相应地，本专利技术涉及一种修饰宿主细胞中的靶标位点的方法，其包括使所述宿主细胞与Cas核酸酶接触，其中所述方法还包括使所述宿主细胞与低亲和力Cas抑制剂和/或亚抑制浓度的Cas抑制剂接触。
[0007]如在下文中使用的，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任何任意语法变型以非排他方式使用。因此，这些术语既可指除了由这些术语引入的特征之外在上下文中描述的实体中不存在更多的特征的情况，也可指还存在一个或多个更多的特征的情况。作为一个实例，表达“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”都可指其中除B外在A中不存在其他要素的情况(即，其中A仅且排他地由B组成的情况)并且可指其中除B外在实体A中还存在一个或多个更多的要素如要素C、要素C和D或甚至更多的要素的情况。
[0008]此外，如在下文中使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选的特征结合使用而不限制更多的可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选的特征而不旨在以任何方式限制权利要求的范围。本领域技术人员将认识到，本专利技术可通过使用替代的特征来执行。类似地，由“在一个实施
方案中”或类似的表达引入的特征旨在是任选的特征，而对本专利技术的更多实施方案没有任何限制，对本专利技术的范围没有任何限制，且对组合以这样的方式引入的特征与本专利技术的其他任选或非任选特征的可能性没有任何限制。
[0009]如本文所用，术语“标准条件”，如果没有另外说明，则指IUPAC标准环境温度和压力(SATP)条件，即优选地，25℃的温度和100kPa的绝对压力；还优选地，标准条件包括为7的pH。而且，如果没有另外指示，则术语“约”指指示值加上相关领域中普遍接受的技术精度，优选地指指示值
±
20％，更优选
±
10％，最优选
±
5％。此外，术语“基本上”表示不存在会对指示的结果或用途有影响的偏差，即潜在的偏差不会导致指示的结果偏离超过
±
20％、更优选
±
10％、最优选
±
5％。因此，“基本上由
……
组成”指包括所指定的组分但不包括除以杂质存在的材料、因用来提供组分的过程而存在的不可避免的材料和出于实现本专利技术的技术效果之外的目的而添加的组分外的其他组分。例如，使用表述“基本上由
……
组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载剂等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％，更优选小于3重量％，甚至更优选小于1重量％，最优选小于0.1重量％的一种或多种未指定组分。在核酸序列的上下文中，术语“基本上相同”表示至少80％，优选至少90％，更优选至少98％，最优选至少99％的％同一性值。如将理解的，术语基本上相同包括100％同一性。上述内容比照地适用于术语“基本上互补”。
[0010]本专利技术的方法可以是体外方法或体内方法。优选地，所述方法为体外方法；因此，所述方法优选为不在人体或动物体上进行的方法，更优选在分离的细胞上进行，最优选在不重新施用于人体或动物体的分离的宿主细胞上进行。还优选地，所述方法为体内方法；因此，优选地，所述方法为在人体或动物体上进行的方法。应理解，在所述方法为体内方法的情况下，它可以是治疗和/或预防如本文别处指定的疾病的方法。所述方法可包括除了上面明确提到的那些外的步骤。例如，更多的步骤可涉及例如为步骤a)提供宿主细胞，或在步骤b)之后孵育宿主细胞。而且，所述步骤中的一个或多于一个可由自动化设备执行。优选地，所述方法为特异性地修饰宿主细胞中的基因和/或修饰基因的表达，优选特异性地修饰宿主细胞中的基因的方法。还优选地，所述方法还包括使所述宿主细胞与至少一种指导RNA(gRNA)，优选地至少一种与目标靶标位点特异性结合的gRNA接触。为目标靶标位点设计gRNA的原则是技术人员已知的，例如从上文引用的文献已知。
[0011]如本文所用，术语“靶标位点”指包含在宿主细胞中的多核苷酸中的核酸序列，优选包含在所述宿主细胞中的基因组DNA、细胞器DNA或质粒中的核酸序列。优选地，靶标位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含(i)Cas核酸酶和(ii)低亲和力Cas抑制剂的多肽或多肽复合物。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述Cas核酸酶和所述低亲和力Cas抑制剂作为融合多肽被包含。3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述融合多肽包含经由接头肽连接的所述Cas核酸酶和所述低亲和力Cas抑制剂。4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述接头肽为包含GS和/或GG的接头，优选包含GGSG(SEQ ID NO：13)的接头，更优选(GGSG)
n
接头，其中n为1至100的整数，优选2至50的整数，更优选3至25的整数，甚至更优选为约10，最优选为10。5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Cas核酸酶为Cas9内切核酸酶。6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述Cas抑制剂为Acr多肽，优选为AcrIIA4多肽。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述低亲和力Cas抑制剂为AcrIIA4多肽的突变蛋白，其包含至少一个选自以下列表的突变：(i)M77A；(ii)D76A/M77A；(iii)；(iv)D14A；(v)D14A/Y15A；(vi)D14A/G38A；(vii)G38A；(viii)D37A/G38A；(ix)D14A/G38A；(x)氨基酸N64/Q65/E66的缺失和LOV
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结构域的插入；(xi)氨基酸N64/Q65/E66的缺失；(xii)包含T406A、T407A、G528A和N538E突变的LOV
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结构域的插入；和(xiii)(i)至(xii)的任意组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述多肽的靶标位点的编辑频率与所述多肽的任何脱靶位点的编辑频率的比为至少2，优选至少5，更优选至少7...

【专利技术属性】
技术研发人员：扎比内，
申请(专利权)人：柏林夏瑞蒂医科大学，
类型：发明
国别省市：