通过靶向整合ζ缺陷型嵌合抗原受体转基因重编程免疫细胞制造技术

本发明专利技术涉及用于将CD3ζ缺陷型嵌合抗原受体(CAR)片段靶向并整合至宿主基因组的内源CD3ζ/CD247基因中的核酸构建体。本发明专利技术进一步涉及表达编码CD3ζ缺陷型CAR片段的外源核酸序列的基因修饰的人细胞，该外源核酸序列被框内整合至内源CD3ζ/CD247基因中用于基因融合，以形成包含与内源CD3ζ结构域融合的外源CAR片段的功能性CAR。CAR片段的功能性CAR。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过靶向整合
ζ
缺陷型嵌合抗原受体转基因重编程免疫细胞


[0001]本专利技术涉及治疗性细胞产品的基因修饰领域。本专利技术涉及用于将CD3ζ缺陷型嵌合抗原受体(CAR)片段(转基因)靶向并整合至内源CD3ζ/CD247基因中用于产生基因融合的核酸构建体，并且因此涉及包含与内源CD3ζ结构域融合的外源CAR片段的功能性CAR。
[0002]本专利技术进一步涉及包含三个核酸序列区的所述构建体，其中第一核酸序列区编码嵌合抗原受体(CAR)片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，第二核酸序列区包含被配置用于将构建体整合在人细胞的内源CD3ζ基因处的靶向序列，以及编码和或包含在第一序列区上游的蛋白分离位点的第三核酸序列区。
[0003]在其他些方面，本专利技术涉及作为框内融合蛋白的CAR多肽，其包含外源CAR片段和具有一个或多个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的内源CD3ζ细胞内结构域。本专利技术进一步涉及基因修饰的人细胞，其表达CAR片段，没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，所述CAR片段被框内整合至内源CD3ζ/CD247基因中，以产生包含具有内源CD3ζ链的外源CAR片段的融合CAR。
[0004]本专利技术进一步涉及用于人疾病的治疗专利技术的药物组合物，其包含基因修饰的细胞和药学上可接受的载体。本专利技术进一步涉及在治疗和/或预防医学病症诸如与存在表达癌基因的致病细胞相关的病症中，或用于治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的相应医学用途和治疗方法。

技术介绍
<br/>[0005]迄今为止，最有前景的抗癌免疫治疗策略是基因修饰的T淋巴细胞的过继细胞转移(ACT)。ACT有可能克服许多与基于疫苗的癌症治疗方法相关的缺陷，诸如在体内对肿瘤具有特异性的T细胞的从头激活和扩增，即使在免疫功能低下的患者中亦是如此。ACT使用基因修饰的细胞来识别肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，从而能够根除肿瘤和肿瘤干细胞，并提供治疗已形成的稳健形式的肿瘤的免疫疗法。与传统的化学疗法、放射疗法和手术疗法相比，这种方法有可能预防肿瘤复发。
[0006]癌症免疫治疗领域的主要障碍是打破对“自身”抗原的耐受性。根据靶标的类型，肿瘤特异性免疫应答针对“自身”或“外来”抗原。外来抗原可以在病毒诱发的癌症中产生，或可以通过特定肿瘤特有的遗传变异产生，诸如产生由T细胞和B细胞识别的表位的点突变或染色体重排。然而，针对肿瘤相关自体抗原的免疫应答受中枢或外周耐受机制的抑制。主要问题是胸腺消除高亲和力T细胞受体(TCR)，导致与主要的外来抗原相比，TCR对自体抗原的亲和力相对较低。
[0007]有许多克服癌症免疫疗法应用中的耐受性问题的方法。一种策略是使用嵌合抗原受体(CAR)对T细胞进行基因重定向和重编程。可以将编码抗原受体的基因引入患者的T细胞，然后这些T细胞迅速扩增，从而衍生出能够在体内稳健增殖和具有强大抗肿瘤活性的记忆和效应淋巴细胞。这些合成受体结合了T淋巴细胞的效应功能和抗体以非MHC限制方式识别具有高特异性的预定义表面抗原的能力。
[0008]迄今为止，这项技术在临床上最突出的实例是针对CD19阳性肿瘤的CAR
‑
T细胞疗法。此处，患者的T细胞在洁净室实验室中在体外扩增，并通过逆转录/慢病毒基因转移配备有识别CD19的CAR构建体。输注至患者体内后，基因修饰的CAR
‑
T细胞识别B细胞上和源自B细胞系的癌细胞上的CD19抗原。治疗相应淋巴瘤和白血病的临床成功已导致两种市售CAR
‑
T细胞产品在美国和欧洲获得临床批准(Tisagenlecleucel(Kymriah)，Novartis和Axicabtagen
‑
Ciloleucel(Yescarta)，Kite/Gilead)，其他产品正在进行中。
[0009]已知的CAR通常由细胞外抗原结合结构域组成，该结构域通过接头和跨膜结构域连接细胞内的信号分子。CAR构建体在其组成上是可变的。“第一代”CAR具有用于原代T细胞激活的信号转导链，通常是CD3ζ信号转导链；“第二代”CAR使用CD3ζ链连同共刺激单元，优选是CD28或4
‑
1BB，以提供持续的T细胞以实现激活。“第三代”CAR除了CD3ζ之外，还包括多个共刺激信号转导模块，诸如CD28和4
‑
1BB(或其他)。
[0010]与靶抗原相互作用之后，受体在膜上聚集并发生构象变化，其通过共刺激结构域促进生长和存活，并通过CD3
‑
ζ链模拟T细胞受体信号。后者激活T细胞的细胞毒性功能，并且还刺激细胞因子的产生和释放。除了抗原结合结构域之外，CAR的所有功能组分均是人细胞基因组的天然部分。
[0011]现有技术的主要缺点是CAR
‑
T细胞疗法临床实施的并发症(Elsallab等人.2020)，诸如：
[0012]a)产生自体细胞产品的复杂性，尤其是在接受加强预治疗的癌症患者中，
[0013]b)用自体细胞产品进行治疗的高昂价格(Kymriah，Novartis＝320,000€)，
[0014]c)在应用通用的、因此同种异体的CAR
‑
T细胞产品时，对患者而言至关重要的副作用，
[0015]d)由于组成型表达启动子，转基因T细胞产品耗尽，和
[0016]e)由于插入的构建体的大小，基因转移和整合的效率低，特别是当基因转移通过非病毒且位点特异性基因插入进行时。
[0017]同种异体T细胞产品具有导致通常致命的急性移植物抗宿主(GvHD)反应的高风险，其中由其内源TCR触发的供体的CAR修饰的T细胞将患者的组织识别为“外来的”并对其进行攻击。使用高效且特异性核酸酶，诸如TALEN和CRISPR
‑
Cas9，已经使得特异性地关闭供体的CAR修饰的T细胞的TCR基因成为可能(Gundry等人.2016，Osborn等人.2016)。对同种异体TCR缺失的CAR
‑
T细胞产品的初步研究显示了有前景的结果。然而，尽管TCR缺失，其中一名患者出现轻度GvHD，并且在皮肤中检测到来自供体的T细胞(Quasim等人.2017)。在这项研究中，CAR转基因通过逆转录病毒的方式随机整合至T细胞的基因组中，并且随后在单独的步骤中实现TCR缺失。该技术的缺点是，尽管随后对细胞进行分选，但是最终细胞产品中仍有约0.1％的所有CAR
‑
T细胞继续表达其原始TCR。这可以解释GvHD的发展。
[0018]另一种已建立的策略允许将CAR插入和TCR缺失组合。在这种情况下，CAR插入自动导致TCR缺失。为此，CAR转基因通过TRAC敲入策略插入人TRAC基因座中，其编码TCR
‑
α链的一部分(Eyquem等人.2017)。这导致TRAC敲除和TCR
‑
CD3蛋白复合物的表面表达的缺失。在这项研究中，使用CRISPR
‑
Cas9和腺病毒相关本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸构建体，其包含：
‑
第一核酸序列区，其编码嵌合抗原受体(CAR)片段而没有编码CD3ζ蛋白的功能性细胞内结构域的序列，
‑
第二核酸序列区，其包含被配置成用于将所述构建体整合在人细胞的内源CD3ζ基因处的靶向序列，和
‑
第三核酸序列区，其编码和/或包含在所述第一序列区的上游的蛋白分离位点。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中编码CAR片段的所述第一核酸序列区包含：
‑
编码细胞外抗原结合结构域的核酸序列，所述抗原结合结构域优选包含抗体或抗体片段，
‑
编码跨膜结构域的核酸序列，和
‑
编码一种或多种细胞内共刺激结构域的核酸序列。3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中，所述靶向序列被配置成用于将所述构建体与内源CD3ζ编码序列框内整合，优选整合至内源CD3ζ基因的外显子中。4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述第三核酸序列的蛋白分离位点编码第一自切割肽、蛋白酶切割位点或内部核糖体进入位点(IRES)。5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一序列区被整合至其中的所述CD3ζ基因的靶位点是外显子和/或内含子，优选是外显子2，并且位于编码细胞内结构域或其片段的内源CD3ζ序列的上游，所述细胞内结构域或其片段包含一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中编码CAR片段的所述第一核酸序列区另外包含编码CAR调节蛋白、免疫刺激蛋白和/或治疗性蛋白的序列，所述序列位于框内并通过蛋白分离位点，诸如编码第二自切割肽的序列、启动子和/或IRES位点，与CAR片段编码区分离。7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第二序列区的靶向序列被配置成用于通过基因编辑技术，优选CRISPR
‑
Cas、锌指核酸酶(ZFN)、整合酶、位点特异性重组酶、兆核酸酶、归巢核酸内切酶或TALEN，更优选源自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR
‑
Cas9，整合至宿主基因组中，和/或其中所述靶向序列包含与预期整合至其中的内源DNA序列的识别位点相同的序列，优选地选自由以下组成的组：同源臂、向导RNA靶位点、限制酶识别位点、ZFN识别位点、ZFN切割位点、TALEN DNA结合位点、重组酶识别位点、整...

【专利技术属性】
技术研发人员：约纳斯，
申请(专利权)人：柏林夏瑞蒂医科大学，
类型：发明
国别省市：