作为肾脏疾病的生物标志物的尿液流式细胞术制造技术

本发明专利技术提供一种确认患者患有肾病或发生肾移植排斥反应的可能性的方法，所述方法包括以下步骤：提供来自所述患者的尿样，并确定T细胞、足细胞和近端肾小管上皮细胞的浓度。这些细胞类型的比例用于确定肾病或移植排斥的风险。

Urine flow cytometry as a biomarker of kidney disease

The invention provides a method for confirming the possibility of kidney disease or renal transplant rejection in a patient, the method comprises the following steps: providing a urine sample from the patient, and determining the concentration of T cells, podocytes and proximal renal tubular epithelial cells. The proportion of these cell types is used to determine the risk of kidney disease or transplant rejection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为肾脏疾病的生物标志物的尿液流式细胞术
本专利技术涉及通过分析尿液样品中T细胞、足细胞、肾小管上皮细胞的浓度和它们的比例来检测肾脏疾病和肾移植排斥反应。
技术介绍
目前，肾脏疾病主要通过评估肾小球滤过率(肌酐清除率)、分析血液-尿液屏障渗透性(蛋白尿)以及尿液中存在的细胞的显微镜分析来进行诊断。显微镜分析是对通常未染色的细胞的半定量检测，并高度依赖于检查者。目前的非侵入性方法不能保证高灵敏度和特异性。肾移植是终末肾功能不全患者的最佳疗法。然而，每次移植都有移植排斥反应、潜在疾病复发或慢性移植损伤的风险。如果通过上述方法之一在患者中检测到移植功能受损或恶化，则患者通常必须进行肾活组织检查以查明肾功能受损的原因。移植排斥反应可区分为急性细胞、急性体液和慢性体液移植排斥反应。根据肾功能受损的原因，可确定合适的疗法。基于上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种确定患者患有肾病或发生移植排斥反应的可能性的非侵入性方法。该目的通过说明书的权利要求来实现。术语和定义在本说明书的上下文中，术语“急性排斥反应”涉及可在手术后五天开始的排斥形式。移植后的头几个月风险最高，但多年后也可能发生急性排斥反应。在本说明书的上下文中，术语“急性细胞排斥反应”涉及一种急性排斥反应的形式，主要是由侵入移植物的T细胞来介导。在本说明书的上下文中，术语“急性体液排斥反应”涉及一种急性排斥反应的形式，主要是由与移植物交叉反应的抗体来介导。在本说明书的上下文中，术语“慢性排斥反应”涉及比急性反应发展得更慢的排斥形式。慢性排斥反应可能是由反复发作的急性排斥反应发作而引起的。慢性排斥反应通常被认为不适合治疗。在本说明书的上下文中，术语“慢性体液排斥反应”涉及一种慢性排斥反应的形式，主要是由与移植物交叉反应的抗体来介导。在本说明书的上下文中，术语“健康受试者”涉及未被诊断出患有肾病的人。在本说明书的上下文中，术语“高剂量可的松”指每日成人可的松剂量至少为1mg每kg体重，或指对应剂量的替代性的糖皮质激素。在本说明书的上下文中，术语“增强免疫疗法”涉及施用额外的免疫抑制疗法，该疗法通常由高剂量可的松和免疫细胞耗竭抗体或细胞因子阻断抗体组成。在本说明书的上下文中，术语“与分子特异性结合的配体”涉及抗体和抗体样分子。在本说明书的上下文中，术语“抗体样分子”是指能够以高亲和力/Kd≤10E-8mol/l来特异性结合另一分子或靶标的分子。类似于抗体的特异性结合，抗体样分子与其靶标结合。术语抗体样分子包括重复蛋白，比如设计的锚蛋白重复蛋白(MolecularPartners，Zürich)、衍生自犰狳重复蛋白的多肽、衍生自富含亮氨酸的重复蛋白的多肽和衍生自四肽重复蛋白的多肽。术语“抗体样分子”还包括衍生自蛋白A结构域的多肽、衍生自纤连蛋白结构域FN3的多肽、衍生自共有纤连蛋白结构域的多肽、衍生自脂笼蛋白的多肽、衍生自锌指的多肽、衍生自Src同源结构域2(SH2)的多肽、衍生自Src同源结构域3(SH3)的多肽、衍生自PDZ结构域的多肽、衍生自γ-晶状体蛋白的多肽、衍生自遍在蛋白的多肽、衍生自半胱氨酸结多肽的多肽、衍生自打结素类的多肽、核酸适体和肽适体。在本说明书的上下文中，术语“特异性结合”涉及一个分子与另一个分子的结合，其中解离常数为Kd≤10E-8mol/l。在本说明书中，当在标志物表达的上下文中使用时，术语“阳性”是指由荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中与用不特异性结合相同靶标的同种型匹配抗体染色相比，其中值荧光强度至少高30％(≥30％)，特别是≥50％或≥80％。标志物的这种表达在标记物的名称后用“加”(+)表示，例如CD4+。在本说明书中，当在标志物表达的上下文中使用时，术语“阴性”是指由荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中与不特异性结合相同靶标的同种型匹配抗体的中值荧光强度相比，其中值荧光强度小30％，特别是小15％。标志物的这种表达在标记物的名称后用“减”(-)表示，例如CD127-。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供一种确认患者患有肾病或发生肾移植排斥反应的可能性的方法。所述方法包括以下步骤：a.提供来自所述患者的尿样；b.确定所述尿样中的T细胞浓度、足细胞浓度和近端肾小管上皮细胞浓度，并可选地确定所述尿样中的远端肾小管上皮细胞浓度。本领域技术人员知道，在步骤a之后和步骤b之前，从所述尿样中分离细胞。在某些实施例中，所述T细胞的特征在于表达CD3和CD4。在某些实施例中，所述T细胞的特征在于表达CD3和CD8。在某些实施例中，所述T细胞的特征在于表达CD3、CD4和CD8。在某些实施例中，所述T细胞的特征在于表达CD3。在某些实施例中，所述T细胞的特征在于表达CD4和CD8。在某些实施例中，所述足细胞的特征在于表达足糖萼蛋白。在某些实施例中，所述足细胞的特征在于表达足蛋白。在某些实施例中，所述足细胞的特征在于表达去氧肾上腺素。在某些实施例中，所述足细胞的特征在于表达WT1(Wilms瘤蛋白1)。在某些实施例中，所述近端小管上皮细胞的特征在于表达CD10。在某些实施例中，所述近端小管上皮细胞的特征在于表达CD10和细胞角蛋白。在某些实施例中，所述远端小管上皮细胞的特征在于表达EPCAM。在某些实施例中，所述远端小管上皮细胞的特征在于表达EPCAM和细胞角蛋白。通过使从所述尿样中分离的细胞与可检测的配体组接触来实现步骤b。所述配体组包括能够结合CD4、CD8和CD10中的每个的配体、能够结合足糖萼蛋白、足蛋白、去氧肾上腺素和WT1中的至少一个的配体，并可选地能够结合细胞角蛋白、CD3和/或EPCAM的配体。所述配体中的每个能够特异性地结合CD3、CD4、CD8、足糖萼蛋白、足蛋白、去氧肾上腺素、WT1、CD10、细胞角蛋白和EPCAM中的一个。在本说明书的上下文中，CD4是指具有UniProtIDP01730的人蛋白。在本说明书的上下文中，CD8是指具有UniProtIDP01732的人蛋白。在本说明书的上下文中，足蛋白是指具有UniProtIDQ9NP85的人蛋白。在本说明书的上下文中，WT1是指具有UniProtIDP19544的人蛋白。在本说明书的上下文中，去氧肾上腺素是指具有UniProtID060500的人蛋白。在本说明书的上下文中，足糖萼蛋白是指具有UniProtID000592的人蛋白。在某些实施方式中，所述配体是抗体。在某些实施例中，通过流式细胞术来确定所述T细胞浓度、所述足细胞浓度、所述近端肾小管上皮细胞的浓度和可选的所述远端肾小管上皮细胞浓度中的每个。在某些实施例中，所述肾病包括(肾)移植排斥、急性肾功能衰竭、自身免疫性疾病引起的急性肾功能衰竭、狼疮性肾炎、ANCA相关性肾小球肾炎和糖尿病肾病。在某些实施例中，所述肾病是移植排斥反应。在某些实施例中，所述肾病是急性细胞移植排斥本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确认患者患有肾病或发生肾移植排斥反应的可能性的方法，所述肾病特别地选自肾移植排斥、急性肾功能衰竭、自身免疫性疾病引起的急性肾功能衰竭、狼疮性肾炎、ANCA相关性肾小球肾炎和糖尿病肾病，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/na.提供从所述患者获得的尿样；/nb.确定所述尿样中的T细胞浓度、足细胞浓度和近端肾小管上皮细胞浓度，并可选地确定所述尿样中远端肾小管上皮细胞浓度。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170325 EP 17162941.3;20170405 EP 17165128.4;20171.一种确认患者患有肾病或发生肾移植排斥反应的可能性的方法，所述肾病特别地选自肾移植排斥、急性肾功能衰竭、自身免疫性疾病引起的急性肾功能衰竭、狼疮性肾炎、ANCA相关性肾小球肾炎和糖尿病肾病，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a.提供从所述患者获得的尿样；
b.确定所述尿样中的T细胞浓度、足细胞浓度和近端肾小管上皮细胞浓度，并可选地确定所述尿样中远端肾小管上皮细胞浓度。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
-所述T细胞的特征在于表达CD3、CD4和CD8中的至少一个，
-所述足细胞的特征在于表达足糖萼蛋白、足蛋白、去氧肾上腺素和WT1中的至少一个，
-所述近端小管上皮细胞的特征在于表达CD10，
-所述远端小管上皮细胞的特征在于表达EPCAM，
并且，通过使所述细胞与配体组接触来实现步骤b，其中所述配体组包括能够结合CD4、CD8和CD10中的每种的配体、能够结合足糖萼蛋白、足蛋白、去氧肾上腺素和WT1中的一种的配体，并可选地能够结合细胞角蛋白、CD3和/或EPCAM的配体，其中所述配体中的每个能够特异性地结合CD3、CD4、CD8、足糖萼蛋白、足蛋白、去氧肾上腺素、WT1、CD10、细胞角蛋白和EPCAM中的一种。


3.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过流式细胞术来确定所述T细胞浓度、所述足细胞浓度、所述近端肾小管上皮细胞的浓度和可选的所述远端肾小管上皮细胞浓度中的每个。


4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
c.根据步骤b中确定的所述T细胞浓度、所述足细胞浓度、所述近端和远端肾小管上皮细胞浓度来确定足细胞/T细胞比例、足细胞/近端小管上皮细胞比例、足细胞/远端小管上皮细胞比例、T细胞/近端小管上皮细胞比例和/或T细胞/远端小管上皮细胞比例；
d.将步骤c中确定的所述足细胞/T细胞比例、所述足细胞/近端小管上皮细胞比例、所述T细胞/近端小管上皮细胞比例和/或所述T细胞/远端小管上皮细胞比例与阈值进行比较；
e.确认所述患者具有患有肾病或发生肾移植排斥反应的高可能性：
i.如果所述足细胞/T细胞比例低于足细胞/T细胞阈值和/或
ii.如果所述足细胞/近端小管上皮细胞比例高于足细胞/近端小管上皮细胞阈值和/或
iii.如果所述足细胞/远端小管上皮细胞比例高于足细胞/近端小管上皮细胞阈值和/或
iv.如果所述T细胞/近端小管上皮细胞比例高于T细胞/近端小管上皮细胞阈值和/或
v.如果所述T细胞/远端小管上皮细胞比例高于T细胞/远端小管上皮细胞阈值。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步在所述T细胞浓度高于T细胞阈值的情况下，确认所述患者具有发生肾移植排斥反应的高可能性，
特别地，其中
-所述T细胞阈值为2000-500个T细胞/100ml尿液，特别地1500-550个T细胞/100ml尿液，更特别地1000-600个T细胞/100ml尿液，甚至更特别地约600个T细胞/100ml尿液；
-所述足细胞/T细胞阈值为0.01-0.3，特别地0.02-0.2，更特别地0.1-0.2，甚至更特别地约0.2；
-所述足细胞/近端小管上皮细胞阈值为1-13，特别地1.5至10，更特别地2-5，甚至更特别地约3；
-所述T细胞/近端小管上皮细胞阈值为0.2；和/或
-所述T细胞/远端小管上皮细胞阈值为0.02。


6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步在所述T细胞浓度高于T细胞阈值的情况下，确认所述患者具有患有肾病的高可能性，
特别地，其中
-所述T细胞阈值为1500-200个T细胞/100ml尿液，特别地1000-250个T细胞/100ml尿液，更特别地800-300个T细胞/100ml尿液，甚至更特别地约400个T细胞/100ml尿液；
-所述足细胞/T细胞阈值为10-2，特别地8-3，更特别地6-4，甚至更特别地约5；
-所述足细胞/近端小管上皮细胞阈值为0.5-5，特别地0.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普·英格，尼娜·格里克，汉娜·安东尼娅·布兰德，瓦莱丽·朗汉斯，佩特拉·雷因克，
申请(专利权)人：柏林夏瑞蒂医科大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE