一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法技术

一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：尿液样品经离心、稀释后直接引入反相色谱飞行时间质谱仪进行测定，经过峰对齐、校正和标准化、多变量统计分析和谱库检索可以找到喉癌志愿者和健康志愿者尿液中的差异代谢物。本发明专利技术为全新的尿液中差异代谢物的鉴定方法，通过差异代谢物可以反应喉癌患者尿液代谢物的变化情况，将有助于喉癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。

A method for the determination and screening of differentially expressed metabolites in urine of laryngeal carcinoma based on reverse phase chromatography time of flight mass spectrometry

A laryngeal cancer urine based on the difference of reversed-phase chromatography time-of-flight mass spectrometry determination of metabolite screening method, which is characterized in that: the urine samples were centrifuged and diluted directly into the reverse phase chromatography time-of-flight mass spectrometer were determined after analysis of peak alignment, correction and standardization, multivariate statistical and spectral database can find differences in urine of volunteers and laryngeal carcinoma the metabolites in healthy volunteers. The invention relates to a method for identifying differentially new urine metabolites, the differences of metabolites can change reaction in patients with laryngeal carcinoma urinary metabolites, research will be useful for diagnosis and treatment of laryngeal carcinoma, prognosis and pathogenesis.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于尿液的理化检验
，具体说是一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法。
技术介绍
：喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占全身恶性肿瘤的5%，近年来发病率呈升高趋势，且男性发病率高于女性，喉癌发病年龄多在40岁以上，其中以60~70岁发病率为最高，我国华北和东北地区的发病率远高于长江以南各省份。目前，预测喉部病变的金标准是喉镜加病理组织学评价，然而该方法具有创伤性且花费比较高。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。代谢组学技术可以发现新的生物标志物，这将有助于头颈癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。尿液是一种被广泛使用、研究的生物流体，它具有来源广泛，收集方便、无创，且体积比较大等优点，是一种理想的检测介质。由于尿液中大部分是一些非极性和中等极性的化合物，如脂质、氨基酸等，反相色谱对这些化合物具有很好的保留和分离能力，尤其是与飞行时间质谱仪的联用-飞行时间质谱具有高的灵敏度、分辨率和质量准确度，可以降低数据的复杂程度，从而使得飞行时间质谱的定性能力进一步的提升。目前，采用反相液相色谱飞行时间质谱对喉癌尿液代谢组学进行研究的文献还未见报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的筛选喉癌志愿者和健康志愿者尿液中差异代谢物的液相色谱飞行时间质谱方法，该方法能快速、准确鉴定尿液中的差异代谢物。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，是以喉癌志愿者和健康志愿者尿液为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：a、尿液在室温下解冻，然后在4ºC以10000g的速度离心10min以去除颗粒物；b、用移液枪移取100µL的尿液样本，并加入200µL的纯水，混合均匀，然后装入色谱瓶中待测；c、反相色谱飞行时间质谱对所有尿液样本进行逐一分析，得原始数据；d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA-P进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物。e、用SPSS进行T检验，P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物。f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对等方法进行验证，即为差异代谢物。在c步骤中，反向液相色谱条件为：所有的样品均采用Water公司生产的ACQUITYUPLCHSST3柱（2.1×100mm,1.8µm）进行分离，柱温为35ºC，流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为400μL/min，梯度洗脱条件：0-1min，2%B-2%B；1-15min，2%B-45%B；15-16min，45%B-100%B；16-19min，100%B-100%B；19-20min，100%B-2%B，并维持2min，总分析时间为22min，进样量为5μL。在c步骤中，飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压为3500V，干燥气为4L/min(180℃)，雾化气为0.04MPa，碰撞能量为7eV，传输时间为100µs。本专利技术方法的稳定性和重复性：从每个喉癌志愿者尿液样本和健康志愿者尿液样本取等量的尿液，混合均匀，即为质控（QC）样品，采用质控（QC）样品来评价仪器的稳定性和重复性以确保实验结果的可靠性，选取m/z分别180.0651，274.2731，320.1395，473.1515和551.3940来评价仪器的稳定性和重复性，这五个内生性化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）见表1，保留时间RSD小于1%，峰面积RSD小于20%，说明系统的稳定性和重复性均符合要求。表1方法的稳定性和重复性本专利技术的方法是一种喉癌尿液差异代谢物的发现方法，针对尿液样本优化了前处理方法，并对液相色谱飞行时间质谱的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。本专利技术方法具有如下优良效果：①液相色谱飞行时间质谱具有灵敏度高、分辨率高等优点。②本方法前处理简便，不需要经过复杂的固相萃取过程，可以提高分析通量，具有快速及重复性好的优点。附图说明图1.喉癌志愿者（a）和健康志愿者尿液的色谱图（b）。图2.喉癌志愿者尿液样本和健康志愿者尿液样本的得分图，1为健康者，2为喉癌患者。具体实施方式本专利技术以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本专利技术。一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的研究方法，其测试过程是尿液经离心、稀释后直接引入液相色谱飞行时间质谱进行分析。实例1：1．仪器与试剂：实验所使用的液相色谱仪为Dionex的UltiMate3000，包括液相泵（HPG-3400SD）、自动进样器（WPS-3000SL）和柱温箱（TCC-3000SD），所有的样品均采用Water公司生产的ACQUITYUPLCHSST3柱（2.1×100mm,1.8µm）进行分离，柱温为35ºC。色谱级甲酸，纯度为98%，购买自TEDIA公司，乙腈，纯度为99.9%，购买自韩国德山药品工业株（DUKSANPURECHEMIVALS），D-泛酸，纯度大于95%，购买自武汉易泰科技有限公司上海分公司；实验用水均为去离子水。2．样品处理：尿液在室温下解冻，尿液在4ºC以10000g的速度离心10min以去除颗粒物，然后用移液枪移取100µL的尿液样本，并加入200µL的纯水，混合均匀，然后装入色谱瓶中待测。3．测定方法：吸取离心、稀释后的样品5µL，注入反相色谱飞行时间质谱系统进行分离分析。4.原始数据转换为mzXML的格式以后，对数据进行峰识别、提取和保留时间校正，具体的参数设置为：质荷比（m/z）允许的误差为10ppm，色谱峰的宽度为10-60s，保留时候的步长设置为1m/z。5.然后使用SIMCA-P13.0Demo软件对XCMSonline提取的数据进行归一化，并进行主成分分析、偏最小二乘判别分析或正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），根据OPLS-DA的结果找到变化比较大的代谢物，然后利用SPSS20.0进行T检验。6.根据VIP>1和P<0.05共发现了几十个潜在的差异代谢物，然后利用飞行时间质谱仪在MRM或者AutoMSn模式下进行二级碎片扫描，在允许误差范围为10ppm的条件下利用二级碎片进行谱库检索，从而确定其为什么化合物（代谢物）。实例2：按实施例1所述的方法，选取37例喉癌志愿者和29例健康志愿者尿液样本，经过数据分析、谱库检索以后鉴定出其中的一个差异代谢物为D-泛酸。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于，是以喉癌志愿者和健康志愿者尿液为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：a、尿液在室温下解冻，然后在4 ºC以10000 g的速度离心10 min以去除颗粒物；b、用移液枪移取100 µL的尿液样本，并加入200 µL的纯水，混合均匀，然后装入色谱瓶中待测；c、反相色谱飞行时间质谱对所有尿液样本进行逐一分析，得原始数据，反相色谱条件为：采用ACQUITY UPLC HSS T3柱 规格2.1 × 100 mm, 1.8 µm进行分离，柱子温度为35 ºC，流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为400 μL/min，梯度洗脱，总分析时间为22 min，进样量为5 μL；飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；ESI+模式：喷雾电压为3500 V，干燥气为4 L/min (180℃)，雾化气为0.04 MPa，碰撞能量为7 eV，传输时间为100 µs；d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA‑P多元数据分析软件进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物；e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物；f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对方法进行验证，即为差异代谢物。...

【技术特征摘要】
1.一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于，是以喉癌志愿者和健康志愿者尿液为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：a、尿液在室温下解冻，然后在4ºC以10000g的速度离心10min以去除颗粒物；b、用移液枪移取100µL的尿液样本，并加入200µL的纯水，混合均匀，然后装入色谱瓶中待测；c、反相色谱飞行时间质谱对所有尿液样本进行逐一分析，得原始数据，反相色谱条件为：采用ACQUITYUPLCHSST3柱规格2.1×100mm,1.8µm进行分离，柱子温度为35ºC，流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为400μL/min，梯度洗脱，总分析时间为22min，进样量为5μL；飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡清源，侯宏卫，张小涛，陈欢，刘勇，王安，刘彤，韩书磊，付亚宁，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41