一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：血清经过有机溶剂‑甲醇沉淀蛋白以后，然后离心、真空离心干燥，然后复溶于200µL的纯水，引入反相色谱飞行时间质谱仪进行测定，经过峰对齐、校正和标准化、多变量统计分析和谱库检索可以找到喉癌志愿者和健康志愿者血清中的差异代谢物。本发明专利技术为全新的血清中差异代谢物的鉴定方法，通过差异代谢物可以反应喉癌患者血清代谢物的变化情况，将有助于喉癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于血清的理化检验
，具体说是一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法。
技术介绍
：常见的喉癌类型为鳞片状细胞癌，具有高发病率和高复发率的特点，且容易发生颈部淋巴结转移。在喉癌的治疗中主要采用手术为主的喉切术，并辅以放化疗，但其对于化疗不敏感，且容易引起患者发音、吞咽功能差，生存质量降低等问题，早期喉癌治疗效果较好而晚期喉癌疗效差，但对于喉癌的早期诊断仍然缺乏十分有效的生物标志物。因此，新的生物标志物的发现对于临床上实现喉癌的早期诊断和治疗具有重要意义。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。代谢组学技术可以发现新的生物标志物，这将有助于头颈癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。对于具有诊断功能的生物标志物的发现，往往采用非入侵或者少入侵的体液，如血液和尿液等。尿液中包含许多的代谢终产物，以及营养物质、药物和外源性物质的代谢物，而血液反应的往往是一些内生性的代谢物。但是对于临床诊断，往往多采用血液，这是因为24小时尿液样本的收集比较繁琐和容易出错，晨尿中化合物的浓度容易受到受试者所摄入的液体（如饮料、水等）的影响，不能完全代表受试者当时的状态，而血液流过受试者的全身，能够很好的反应受试者的身体状况。目前，血清已经被广泛用于肺癌、鼻咽癌的差异代谢物的研究，而用于喉癌差异代谢物的研究还未见报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的筛选喉癌志愿者和健康志愿者血清中差异代谢物的反相色谱飞行时间质谱方法，该方法能快速、准确鉴定血清中的差异代谢物。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，是以喉癌志愿者和健康志愿者血清为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：a、血液在室温下解冻，移取400µL的血清，加入1200µL的甲醇，涡旋混合15s，然后以15800g离心力在离心机中离心15min；b、移取370µL的上清液于2mL的离心管中，然后于真空离心机中离心干燥，然后复溶于200µL的纯水中，然后装入色谱瓶中待测；c、反相色谱飞行时间质谱对所有血清样本进行逐一分析，得原始数据；d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA-P进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物。e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物。f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对等方法进行验证，即为差异代谢物。在c步骤中，所有的样品均采用Water公司生产的ACQUITYUPLC®BEH柱（2.1×150mm,1.7µm）进行分离，柱子温度为50ºC，流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为385μL/min，梯度洗脱条件：0-1min，5%B-5%B；1-10min，5%B-20%B；10-12min，20%B-60%B；12-33min，60%B-100%B；33-35min，100%B-100%B；35-36min，100%B-5%B，并维持2min，总分析时间为38min，进样量为5μL。在c步骤中，飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压为3500V，干燥气为4L/min(180℃)，雾化气为0.04MPa，碰撞能量为7eV，传输时间为100µs。本专利技术方法的稳定性和重复性：从每个喉癌志愿者血清样本和健康志愿者血清样品取等量的血清，混合均匀，即为质控（QC）样品，采用质控（QC）样品来评价仪器的稳定性和重复性以确保实验结果的可靠性，选取m/z分别为265.2024，318.2977，496.3361，675.6710和782.5508来评价仪器的稳定性和重复性，这五个内生性化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）见表1，保留时间的RSD小于1%，峰面积的RSD均小于15%，说明系统的稳定性和重复性均符合要求表1方法的稳定性和重复性峰数目m/z保留时间RSD（%）峰面积RSD（%）1265.20240.849.262318.29770.655.763496.33610.289.744675.67100.2912.45782.55080.197.55本专利技术的方法是一种新的喉癌血清差异代谢物的发现方法，对反相色谱飞行时间质谱的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。本专利技术方法具有如下优良效果：①液相色谱飞行时间质谱灵敏度更高。②本方法前处理简便，不需要经过复杂的固相萃取过程，可以提高分析通量，具有快速及重复性好的优点。附图说明图1.典型的基峰色谱图（上图为健康志愿者，下图为喉癌志愿者）；图2.喉癌志愿者血清样本和健康志愿者血清样本的得分图，1为健康者，2为喉癌患者。具体实施方式本专利技术以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本专利技术。一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其测试过程是血清经过有机溶剂-甲醇沉淀蛋白以后，然后离心、真空离心干燥，然后复溶于200µL的纯水，引入超高效液相色谱-电喷雾电离源-飞行时间质谱仪进行测定。实例1：1．仪器与试剂：实验所使用的液相色谱仪为Dionex的UltiMate3000，包括液相泵（HPG-3400SD）、自动进样器（WPS-3000SL）和柱温箱（TCC-3000SD），所有的样品均采用Water公司生产的ACQUITYUPLC®BEH柱（2.1×150mm,1.7µm）进行分离，柱子温度为50ºC。色谱级甲酸，纯度为98%，购买自TEDIA公司，乙腈，纯度为99.9%，购买自韩国德山药品工业株（DUKSANPURECHEMIVALS），1-十六酰-sn-丙三醇-磷酸胆碱，纯度大于99%，购买自Sigma-Aldrich公司；实验用水均为去离子水。2．样品处理：血清在室温下解冻，移取400µL的血清，加入1200µL的甲醇，涡旋混合15s，然后以15800g离心力在离心机中离心15min，移取370µL的上清液于2mL的离心管中，然后于真空离心机中离心干燥，然后复溶于200µL的纯水中，装入色谱瓶中待测。3．测定方法：吸取前处理后的血清样品5µL，注入反相色谱飞行时间质谱系统进行分离分析。4.原始数据转换为mzXML的格式以后，对数据进行峰识别、提取和保留时间校正，具体的参数设置为：质荷比（m/z）允许的误差为10ppm，色谱峰的宽度为10-60s，保留时候的步长设置为1m/z。5.然后使用SIMCA-P13.0Demo软件对XCMSonline提取的数据进行归一化，并进行主成份分析、偏最小二乘判别分析或正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），根据OPLS-DA的结果找到变化比较大的代谢物，然后利用SPSS20.0进行T检验。6.根据VIP>1和P<0.05共发现了一百多个潜在的差异代谢物，然后利用飞行时间质谱仪在MRM或者AutoMSn模式下进行二级碎片扫描，在允许误差范围为10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：是以喉癌志愿者和健康志愿者血清为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：a、血液在室温下解冻，移取400 µL的血清，加入1200 µL的甲醇，涡旋混合15 s，然后以15800 g离心力在离心机中离心15 min；b、移取370 µL的上清液于2 mL的离心管中，然后于真空离心机中离心干燥，然后复溶于200 µL的纯水中，然后装入色谱瓶中待测；c、反相色谱飞行时间质谱对所有血清样本进行逐一分析，得原始数据；反相色谱条件为：采用ACQUITY UPLC® BEH柱 ，规格2.1 × 150 mm, 1.7 µm进行分离，柱子温度为50 ºC，流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为385 μL/min，梯度洗脱，总分析时间为38 min，进样量为5 μL；飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压为3500 V，干燥气为4 L/min (180℃)，雾化气为0.04 MPa，碰撞能量为7 eV，传输时间为100 µs；d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA‑P多元数据分析软件进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物；e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物；f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对方法进行验证，即为差异代谢物。...
【技术特征摘要】
1.一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：是以喉癌志愿者和健康志愿者血清为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：a、血液在室温下解冻，移取400µL的血清，加入1200µL的甲醇，涡旋混合15s，然后以15800g离心力在离心机中离心15min；b、移取370µL的上清液于2mL的离心管中，然后于真空离心机中离心干燥，然后复溶于200µL的纯水中，然后装入色谱瓶中待测；c、反相色谱飞行时间质谱对所有血清样本进行逐一分析，得原始数据；反相色谱条件为：采用ACQUITYUPLC®BEH柱，规格2.1×150mm,1.7µm进行分离，柱子温度为50ºC，流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈，流动相流速为385μL/min，梯度洗脱，总分析时间为38min，进样量为5μL；飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡清源，侯宏卫，张小涛，陈欢，刘勇，王安，刘彤，韩书磊，付亚宁，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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