本发明专利技术涉及一种低分子肝素的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，该方法利用离子对反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素的各个组分，通过离子对反相色谱分离样品中各主要组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，计算出其糖链序列信息，包括两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，从而对低分子肝素的结构进行比较精细的表征。本发明专利技术对于提高肝素的检测水平、保障药品安全具有极大的实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种低分子肝素的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，属于药物、原料药、原料检测
技术介绍
肝素是一种糖胺聚糖类药物，具有强抗凝作用，是治疗血栓栓塞性疾病的首选药物。低分子肝素是肝素经化学方法或者酶法降解制备而成，常见的有依诺肝素钠(Enoxaparin)、那屈肝素I丐(Nadroparin)和达 肝素钠(Dalteparin)等。与肝素相比,低分子肝素抗血栓活性较高、抗凝活性较低，具有出血副作用小、生物利用度高、体内半衰期长等优势，受到越来越广泛的关注和应用。由于肝素及低分子肝素具有强极性、不均一性、硫酸基团不稳定等特点，其结构表征十分困难。通常分析低分子肝素的方法有凝胶电泳(Cowman M K, etal. Biochemical Journal, 1984，221 (3) : 707-716.)及 HPSEC 法(Ahsan A, et al. Journalof Pharmaceutical Sciences, 1995，84 (6) : 724-727.)，但通过这些方法仅能获得非常粗略的分子量信息。用肝素酶将低分子肝素降解成肝素二糖，然后用离子对反相色谱与质谱联用技术分析二糖组成是近年来比较常用的表征方法(Zhang F，et al. Analytical andBioanalytical Chemistry, 2011, 401 (9) :2793-2803.)，但由于检测样品为降解后的肝素二糖，导致该方法不能鉴定未经破坏的完整低分子肝素糖链的结构。除以上提及的方法外，美国药典、欧洲药典和中国药典规定的低分子肝素的检测方法也都是分析低分子肝素混合物，只能对混合物进行表征，而不能对其中的各单一组分进行直接的分析。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种低分子肝素的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，可用于全谱图鉴定低分子肝素原料药和注射剂中主要肝素糖链的结构。专利技术概述本专利技术利用离子对反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素的各个组分，通过离子对反相色谱分离样品中各主要组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，计算出其糖链序列信息，包括两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，从而对低分子肝素的结构进行比较精细的表征。专利技术详述，步骤如下(I)将胺类离子对试剂溶解于去离子水,用pH调节试剂调pH值至5. 5 8. 5,制得浓度为10 30mM的流动相A ;本步骤中所述浓度是指胺类离子对试剂中溶质在流动相A中的摩尔浓度；(2)将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%甲醇溶液，用PH调节试剂调pH值至5. 5 8. 5，制得浓度为10 30mM的流动相B ;本步骤中所述浓度是指胺类离子对试剂中溶质在流动相B中的摩尔浓度；(3)将待测低分子肝素样品溶于流动相A，配制成浓度为6 10mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C18反相色谱柱；在流速8 12 μ L/min,洗脱梯度为0 5min，80%流动相A, 20%流动相B ;5 65min，40 80%流动相A，20 60%流动相B，检测器波长为232nm的条件下进行检测，得到紫外检测色谱图；(4)然后，通过在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；(5)通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤(4)获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m 正离子模式m=zM-nX_zY负离子模式m=zM_nX+zY其中z表示电荷数，η表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表不质子氢的分子量；(6)然后使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，数据库变量为肝素链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，用步骤(5)中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值I，按误差值I的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值II与误差值I进行比对，选取误差值II与误差值I最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的低分子肝素种类、肝素糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量信息。所述步骤(I)中的胺类离子对试剂选自正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺、正己胺。所述步骤(I)中的pH调节试剂为六氟异丙醇、甲酸。所述步骤(4)中的高分辨质谱如采用离子阱时间飞行串联质谱仪(IT-T0F)，设定参数为正离子模式喷雾电压+3. 6kV ;负离子模式喷雾电压-3. OkV ;喷雾气流速1. 5L/min ;扫描质量范围50 5000 ;如果采用四级杆时间飞行串联质谱仪(Q-T0F)，设定参数为正离子模式喷雾电压+5. 5kV ;负离子模式喷雾电压-4. OkV ;帘气压25psi ;喷雾气压30psi ;扫描质量范围50 4000。有益效果本专利技术可以检测低分子肝素的种类和各单一组分的两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，解决了现有技术中检测低分子肝素分子量不精确、无法检测各单一组 分的问题，对于提高肝素的检测水平、保障药品安全具有极大的实用价值。附图说明图I欧盟依诺肝素钠对照品的紫外检测色谱图；图2欧盟依诺肝素钠对照品的总离子流图；图3欧盟依诺肝素钠对照品的高分辨质谱图示例；图4依诺肝素钠注射液样品的紫外检测色谱图；图5依诺肝素钠注射液样品的总离子流图6欧盟那屈肝素钙对照品的紫外检测色谱图；图7欧盟那屈肝素钙对照品的总离子流图；图8欧盟达肝素钠对照品的紫外检测色谱图；图9欧盟达肝素钠对照品的总离子流图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。液相色谱仪为Agilent 1100 series毛细管液相色谱仪,检测器为二极管阵列检测器，工作站为Agilent ChemStation ;质谱为岛津IT-TOF型高分辨质谱，工作站为LC-Solution0实施例I :，步骤如下I. I将正戊胺溶解于去离子水，用甲酸调pH值至7.0，制得正戊胺浓度为15mM的流动相A ； I. 2将正戊胺溶解于溶解于体积百分比为75%的乙腈溶液，用甲酸调pH值至7. O,制得正戊胺浓度为15mM的流动相B ；1.3称取一定量欧盟依诺肝素钠对照品(批号出&丨吐/1於n° 4)，用流动相A配置成8mg/mL的待测溶液,用O. 22 μ m的水相膜过滤后备用；I. 4使用填料粒径为5 μ m、色谱柱内径为O. 5mm、色谱柱长度为250mm的C18反相色谱柱；在流速10 μ L/min,洗脱梯度为0 5min,80%流动相A, 20%流动相B ;5 65min,40 80%流动相A，20 60%流动相B，检测器波长为232nm的条件下进行检测，得到紫外检测色谱图；I. 5使用岛津IT-TOF高分辨质谱在正离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图，设定参数为喷雾电压+3. 6kV ;喷雾气流速1. 5L/min ;扫描质量范围50 5000。I. 6根据步骤I. 5中获得的高分辨质谱图中获得的主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m:m=zM-nX-zY其中z表示电荷数，η表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）将胺类离子对试剂溶解于去离子水，用pH调节试剂调pH值至5.5～8.5，制得浓度为10～30mM的流动相A；（2）将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%甲醇溶液，用pH调节试剂调pH值至5.5～8.5，制得浓度为10～30mM的流动相B；（3）将待测低分子肝素样品溶于流动相A，配制成浓度为6～10mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C18反相色谱柱；在流速8～12μL/min，洗脱梯度为：0～5min，80%流动相A，20%流动相B；5～65min，40～80%流动相A，20～60%流动相B，检测器波长为232nm的条件下进行检测，得到紫外检测色谱图；（4）然后，通过在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；（5）通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤（4）获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：正离子模式：m=zM？nX？zY负离子模式：m=zM？nX+zY其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量；（6）然后使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为：通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，数据库变量为肝素链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，用步骤（5）中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值I，按误差值I的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值II与误差值I进行比对，选取误差值II与误差值I最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的低分子肝素种类、肝素糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量信息。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：迟连利，李道远，王章杰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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