CRISPR相关蛋白反应性T细胞免疫制造技术

本发明专利技术涉及用于测定针对CRISPR相关蛋白的T细胞介导的免疫的方法，该方法通过使自患者获得的所述细胞制剂与CRISPR相关蛋白或表示其氨基酸序列的肽混合物或经操作而含有CRISPR蛋白多肽的细胞接触，从而提供激活的T细胞。随后，通过特异性配体标记所述激活的T细胞的一个或多个亚群并计数，并使用激活的调节性T细胞与激活的效应T细胞的比率(T

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRISPR相关蛋白反应性T细胞免疫
本专利技术涉及在患者中诊断对CRISPR相关蛋白的T细胞介导免疫的方法，并且涉及用于CRISPR疗法的调节性T细胞制剂。
技术介绍
SpCas9(来自化脓链球菌(Streptococcus(S.)pyogenes)的Cas9酶)是第一个被劫持以在特定DNA序列处引入DNA双链断裂的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸酶。通过靶适应的容易性和显著的功效，其被发展为研究和潜在临床应用中最流行的基因重写工具。CRISPR/Cas9技术的临床翻译的主要关注点是脱靶活性引起潜在有害的突变或染色体畸变的风险。高保真Cas9酶被开发出来，以降低这些事件的可能性。此外，新的基于Cas9的融合蛋白允许碱基编辑或特异性表观遗传重编程而不诱导DNA断裂。大多数方法基于源自兼性致病化脓链球菌的原始SpCas9酶。约12％的18岁以下的儿童的化脓链球菌12在咽喉的黏膜无症状定殖。化脓链球菌相关的咽炎及脓皮病为世界范围内与化脓链球菌感染相关的最常见疾病。考虑到化脓链球菌感染的高流行率，专利技术人假设本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于确定针对CRISPR相关蛋白，特别是针对Cas9或Cas12，更特别是针对SpCas9，或针对此类CRISPR相关蛋白的同源物的，T细胞介导的免疫的方法，该方法包括以下步骤/n·提供从患者获得的包含T细胞的细胞制剂；/n·在刺激步骤中，将所述细胞制剂接触/n-分离的CRISPR相关蛋白多肽，特别是Cas9或Cas12多肽，更特别是SpCas9多肽，或此CRISPR相关蛋白的同源物，或/n-多种肽，其中所述多种肽代表所述CRISPR相关蛋白多肽的，特别是所述Cas9或Cas12多肽的、更特别是所述SpCas9多肽的、或其同源物的，氨基酸序列，或/n-细胞，包括CRISPR相关蛋白多肽...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180322 EP 18163491.6;20180323 EP 18163801.6;20181.一种用于确定针对CRISPR相关蛋白，特别是针对Cas9或Cas12，更特别是针对SpCas9，或针对此类CRISPR相关蛋白的同源物的，T细胞介导的免疫的方法，该方法包括以下步骤
·提供从患者获得的包含T细胞的细胞制剂；
·在刺激步骤中，将所述细胞制剂接触
-分离的CRISPR相关蛋白多肽，特别是Cas9或Cas12多肽，更特别是SpCas9多肽，或此CRISPR相关蛋白的同源物，或
-多种肽，其中所述多种肽代表所述CRISPR相关蛋白多肽的，特别是所述Cas9或Cas12多肽的、更特别是所述SpCas9多肽的、或其同源物的，氨基酸序列，或
-细胞，包括CRISPR相关蛋白多肽，特别是Cas9或Cas12，更特别是SpCas9，或此类CRISPR相关蛋白的同源物，
在抗原呈递细胞存在下，特别是在自体外周血单核细胞存在下，
提供激活的T细胞；
·任选地，在所述刺激步骤的最后部分期间，向所述细胞制剂中加入细胞内蛋白转运抑制剂，特别是布雷菲德菌素A和/或莫能菌素；
·在检测步骤中，通过以下步骤检测所述激活的T细胞的一个或多个亚群
-将所述激活的T细胞与对激活的调节性T细胞特异的分子探针组接触，和/或
-将所述激活的T细胞与对激活的效应T细胞特异的分子探针组接触，
提供标记的激活的调节性T细胞和/或标记的活化的效应T细胞；
·在定量步骤中，测定所述标记的激活的调节性T细胞的数目和所述标记的激活的效应T细胞的数目，和任选地，测定所述标记的激活的调节性T细胞的数目与所述标记的激活的效应T细胞的数目的比率(TREG/TEFF)。


2.一种用于确定编码能够特异性识别HLA呈递抗原的T细胞受体分子的核酸序列的方法，所述HLA呈递抗原源自CRISPR相关蛋白，特别是源自Cas9或Cas12蛋白、更特别是源自SpCas9蛋白、或源自此类CRISPR相关蛋白的同源物，所述方法包括以下步骤
·提供从患者获得的包含T细胞的细胞制剂；
·在刺激步骤中，将所述细胞制剂接触
-分离的CRISPR相关蛋白多肽，特别是Cas9或Cas12多肽，更特别是SpCas9多肽，或此类CRISPR相关蛋白的同源物，或
-多种肽，其中所述多种肽代表所述CRISPR相关蛋白多肽的氨基酸序列，特别是所述Cas9或Cas12多肽、更特别是所述SpCas9多肽、或其同源物，或
-细胞，包括CRISPR相关蛋白多肽，特别是Cas9或Cas12、更特别是SpCas9，或此类CRISPR相关蛋白的同源物，
在抗原呈递细胞存在下，特别是在自体外周血单核细胞存在下，
提供激活的T细胞；
·任选地，在所述刺激步骤的最后部分期间，向所述细胞制剂中加入细胞内蛋白转运抑制剂，特别是布雷菲德菌素A和/或莫能菌素；
·在分离步骤中，通过以下步骤分离所述激活的T细胞的一个或多个亚群
-将所述激活的T细胞与对激活的调节性T细胞特异的分子探针组接触，和/或
-将所述激活的T细胞与对激活的效应T细胞特异的分子探针组接触，
以及从所述制剂中除去CRISPR特异性调节性T细胞群和/或CRISPR特异性活化效应T细胞群；
·在序列测定步骤中，测定包含在所述CRISPR特异性T细胞群中的编码CRISPR特异性T细胞受体分子的一个或多个核酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在权利要求1的检测步骤中或在权利要求2的分离步骤中，将细胞指定为激活的调节性T细胞，所述激活的调节性T细胞是
-对CD3、CD4、CD137和CD25呈阳性，其中CD25高表达，而对CD154呈阴性，且
-对FoxP3呈阳性和/或对helios呈阳性和/或对CD127呈阴性，
-并且任选地，对CD69、CD71、CD103、CD134、GARP、HLA-DR、IFNγ、IL-10、KLRG1、LAP、SATB1、TGFβ或TNFα中的任一种呈阳性。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在权利要求1的检测步骤中或在权利要求2的分离步骤中，所述对激活的效应T细胞特异的分子探针组包含
·对CD3、CD4、CD137和CD154特异的配体，和任选地，对CD69、CD71、CD80、CD86、CD107a、CD134、粒酶B、HLA-DR、IFNγ、IL-2、KLRG1、穿孔素或TNFα中的任何一者特异的一种或多种配体；和/或
·对CD3、CD8和CD137特异的配体，和任选地，对CD69、CD71、CD80、CD86、CD107a、CD134、粒酶B、HLA-DR、IFNγ、IL-2、KLRG1、穿孔素或TNFα中的任一种特异的一种或多种配体；和/或
·对CD3、CD4和CD137特异的配体，和对CD25、FoxP3和Helios特异的一种或多种配体，以及任选地，对CD69、CD71、CD80、CD86、CD107a、CD134、粒酶B、HLA-DR、IFNγ、IL-2、KLRG1、穿孔素或TNFα中的任一种特异的一种或多种配体；
特别是其中在所述分离步骤或所述检测步骤中，将细胞指定为激活的效应T细胞，其对CD3和CD137阳性，和
·对CD4和CD154呈阳性，或
·对CD8呈阳性，或
·对CD4呈阳性，和
-对CD25呈阳性，其中CD25低表达，和/或
-FoxP3或Helios阴性；
并且任选地，对CD69、CD71、CD80、CD86、CD107a、CD134、粒酶B、HLA-DR、IFNγ、IL-2、KLRG1、穿孔素或TNFα中的任一种呈阳性。


5.根据权利要求2、3或4中任一项所述的方法，其中针对所述患者确定MHC-II同种型的表达，并且将所述编码CRISPR特异性T细胞受体分子的序列指定至MHC-II同种型组。


6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中针对以共有的MHC-II单倍型为特征的多个患者重复所述方法，并且将由显著数量的所述患者共用的CRISPR特异性T细胞受体分子指定至MHC-II匹配组。


7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中仅分离CRISPR特异性调节性T细胞，并且测定编码CRISPR特异性调节性T细胞受体分子的核酸，或其中仅分离CRISPR特异性效应T细胞，并且测定编码CRISPR特异性效应T细胞受体分子的核酸。


8.根据权利要求1、3或4中任一项的方法，其中所述比率TREG/TEFF被指定为所述患者通过细胞毒性免疫应答对包含CRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：利拉·阿米尼，佩特拉·雷克，迈克尔·施穆克亨内塞，迪特尔·沃克，迪米特里奥斯·瓦格纳，德西蕾·文德尔，
申请(专利权)人：柏林夏瑞蒂医科大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE