一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统及其应用，具体地，涉及一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统，所述缓冲系统包括pH缓冲液；二价阳离子；还原剂和稳定剂。其特征在于，所述pH缓冲液是将pH值维持在7.0‑9.0的pH缓冲液；所述二价阳离子为镁离子；所述还原剂选自DTT、β‑巯基乙醇和TCEP中的一种或任意几种；所述稳定剂选自BSA、甘油和PEG中的一种或任意几种。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统及其应用
本专利技术涉及一种缓冲系统，尤其涉及一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas系统全名为成簇的规则间隔的短回文重复及关联蛋白系统(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedProteins)。是细菌体内的获得性免疫系统，用于对抗侵入细菌的外源DNA、质粒和噬菌体等。基于这一机制，科学家们开发出了CRISPR/Cas技术来利用RNA引导Cas核酸酶对多种物种基因组的特定位点进行修饰编辑。目前已发现的CRISPR/Cas系统大体可分为两类，Class1(包含了typeI，III，andIV),和Class2(包含了typeII，typeV和typeVI)。其中TypeV中的Cas12蛋白在人工设计的gRNA引导下特异的识别目标单链/双链DNA序列，便会激活trans活性，无差别的切割反应体系内的ssDNA/ssRNA(reporter，核酸检测器)。申请人在研究Cas蛋白的体外活性时，发现不同配比的缓冲系统对于Cas蛋白的活性影响很大，为了提高Cas蛋白的应用效率，本专利技术提供了一种优化的缓冲系统。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供了一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统，所述缓冲系统包括pH缓冲液；二价阳离子；还原剂；和稳定剂。在一个实施方式中，所述pH缓冲液是将溶液pH值维持在7.0-9.0的pH缓冲液。<br>在优选的实施方式中，所述pH缓冲液是将溶液pH值维持在7.6-8.5的pH缓冲液。在最优选的实施方式中，所述pH缓冲液是将溶液pH值维持在7.9的pH缓冲液。在一个实施方式中，所述pH缓冲液选自下组的一种或任意几种缓冲液：Tris缓冲液，ACES缓冲液、PIPES缓冲液、PBS缓冲液、MOPAS缓冲液、MOPSO缓冲液、Bis-TrisPropane缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液、DIPSO缓冲液、MOBS缓冲液、TAPSO缓冲液、Trizma缓冲液、HEPPSO缓冲液、POPSO缓冲液、TEA缓冲液、EPPS缓冲液、Tricine缓冲液、Gly-Gly缓冲液、Bicine缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、AMPD缓冲液、TABS缓冲液、AMPSO缓冲液、CHES缓冲液。在优选的实施方案中，所述pH缓冲液是Tris缓冲液或HEPES缓冲液。优选的，所述Tris缓冲液选自Tris-盐酸缓冲液、Tris-醋酸缓冲液，优选的，为Tris-醋酸缓冲液。在一个实施方式中，所述二价阳离子为二价镁离子。在一个实施方式中，所述二价镁离子由含有所述镁离子的盐提供，所述盐选自氯化镁、醋酸镁、硫酸镁或柠檬酸镁，优选为，醋酸镁。在一个实施方式中，所述稳定剂选自BSA、甘油、PEG中的一种或任意几种；在一个实施方式中，所述还原剂选自DTT、β-巯基乙醇、TCEP、TCEP盐酸盐中的一种或任意几种；在一个实施方式中，所述pH缓冲液的终浓度为5-100mM，优选，10-50mM，更优选，40mM。在一个实施方式中，所述二价阳离子的终浓度为5-400mM，优选，10-200mM，更优选，30-150mM，更优选，30mM。在一个实施方式中，所述稳定剂的终浓度为5-400ug/mL，优选地10-200ug/mL，更优选的120ug/mL。在一个实施方式中，所述还原剂的终浓度为1-100mM，优选地5-50mM，更优选5-20mM，更优选地12mM。在一个实施方式中，所述缓冲系统的溶剂是有机溶剂或无机溶剂，优选地溶剂是无机溶剂，更优选地，所述缓冲系统的溶剂是水。另一方面，本专利技术还提供了上述缓冲系统在提高Cas12蛋白体外活性中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种提高Cas12蛋白体外活性的方法，所述方法包括提供上述适用于Cas12蛋白的缓冲系统，将Cas12蛋白置于所述缓冲系统中从而表现出体外活性。进一步的，所述体外活性包括cis切割活性和trans切割活性。另一方面，本专利技术还提供了上述缓冲系统在提高Cas12蛋白核酸检测效率中的应用。所述核酸检测通过Cas12蛋白的trans切割活性来实现。另一方面，本专利技术还提供了一种利用Cas12蛋白进行核酸检测的方法，所述方法包括提供上述适用于Cas12蛋白的缓冲系统，将Cas12蛋白置于所述缓冲系统中从而进行核酸检测。上述核酸检测通过Cas12蛋白的trans切割活性来实现。在一个实施方式中，所述Cas12蛋白通过trans切割活性切割单链核酸检测器，所述单链核酸检测器被切割后可以显示出可检测的信号，从而实现核酸检测的目的，如中国专利申请CN2020104781299中记载；所述可检测信号通过以下任一方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。本专利技术提供的缓冲系统可以提高Cas12蛋白切割单链核酸检测器的效率，最快可在3分钟或更短的时间内显示出可检测的信号。本专利技术中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体的任意两种或三种的混合物，例如，单链DNA和单链RNA的组合物、单链DNA和单链DNA-RNA杂交体的组合物、单链RNA和单链DNA-RNA的组合物。在优选的实施方式中，所述单链核酸检测器为单链寡核酸检测器。所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。在其他的实施方式中，单链核酸检测器包括一个或多个的修饰，例如碱基修饰，骨架修饰，糖修饰等，以向核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。合适修饰的例子包括修饰的核酸骨架和非天然核苷间连接，具有修饰主链的核酸包括那些在主链中保留磷原子的核酸和那些在主链中不具有磷原子的核酸。合适的其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基膦酸酯。在一些实施方式中，单链核酸检测器包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷键。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器可以是核酸模拟物；在某些实施方式中，所述核酸模拟物为肽核酸(PNA)，另一类核酸模拟物是基于具有连接到吗啉环上的杂环碱基的连接吗啉基单元(吗啉基核酸)，其他的核酸模拟物还包括环己烯基核酸(CENA)，还包括核糖或者脱氧核糖链。另一方面，本专利技术还提供了一种利用Cas12蛋白在体外结合核酸和/或切割核酸的方法，所述方法包括提供上述适用于Cas12蛋白的缓冲系统，将Cas12蛋白置于所述缓冲系统中以在体外结合核酸和/或切割核酸。所述核酸包括单链核酸、双链核酸。在gRNA的作用下，Cas12蛋白可以结合目标核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统，所述缓冲系统包括pH缓冲液；二价阳离子；还原剂；和稳定剂；/n所述pH缓冲液是将pH值维持在7.0-9.0的pH缓冲液；/n所述二价阳离子为镁离子；/n所述还原剂选自DTT和/或β-巯基乙醇；/n所述稳定剂选自BSA、甘油和PEG中的一种或任意几种。/n

【技术特征摘要】
1.一种适用于Cas12蛋白的缓冲系统，所述缓冲系统包括pH缓冲液；二价阳离子；还原剂；和稳定剂；
所述pH缓冲液是将pH值维持在7.0-9.0的pH缓冲液；
所述二价阳离子为镁离子；
所述还原剂选自DTT和/或β-巯基乙醇；
所述稳定剂选自BSA、甘油和PEG中的一种或任意几种。


2.如权利要求1所述的缓冲系统，其特征在于，
所述pH缓冲液的终浓度为5-100mM；
所述二价阳离子的终浓度为5-400mM；
所述还原剂的终浓度为1-100mM；
所述稳定剂的终浓度为5-400μg/ml。


3.如权利要求1或2所述的缓冲系统，其特征在于，pH缓冲液为Tris缓冲液或HEPES缓冲液。


4.如权利要求1或2所述的缓冲系统，其特征在于，所述二价阳离子为镁离子；所述还原剂选自DTT；所述稳定剂选自BSA。


5.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，陈莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37