新型可控高活性G四链体DNA酶的构建制造技术

本发明专利技术涉及一种间位胞嘧啶增强并利用单碱基修饰技术进一步实现高催化活性G四链体DNA酶的构建。首先，在富含G碱基DNA序列的3’端修饰胞嘧啶及其衍生物，在含有100mM K离子的缓冲中，95℃退火5min，形成G四链体结构。然后将该G四链体与血红素(hemin)混合，形成DNA酶。通过测试不同H

【技术实现步骤摘要】
新型可控高活性G四链体DNA酶的构建一、
本专利技术为一种间位胞嘧啶增强催化活性且可通过胞嘧啶修饰实现新型高催化活性G四链体DNA酶的构建及其制备方法。二、
技术介绍
天然生物催化剂由于其易受环境干扰，作用机制复杂而广受诟病。设计、构建结构简单、催化活性高的仿生酶具有重要意义。目前，人工构建的纳米仿生酶大都集中于纳米粒子，如Fe3O4等。这类纳米仿生酶具有更优的抗环境干扰能力，但仍受限于合成复杂、重复性有限等缺点。G四链体/血红素(hemin)DNA酶因其易于合成、成本低、设计性强、稳定性高等优点，广泛应用于各种纳米领域。然而，DNA酶仍存在活性低的缺点。因此，外源性激活因子或DNA序列修饰策略被应用于提高其催化活性。虽几经努力，DNA酶活性依旧无法与天然酶相媲美。富G序列形成的G平面为hemin提供了一个良好的平台，而空间邻近的胞嘧啶由于其较小的嘧啶环以及环上羰基的存在，导致其激活能力一直不理想。本专利技术在富含G碱基的DNA序列末端修饰间位胞嘧啶，在钾离子辅助下形成分子内平行G四链体，与hemin结合形成了G四链体DNA酶。间位上的胞嘧啶能够显著提高DNA酶的催化活性，进一步对该胞嘧啶进行修饰，可以使之达到与天然酶同数量级的催化活性。这种DNA酶合成方法简单、催化活性高、便于保存，在工业应用上具有很大的应用前景。三、
技术实现思路
本专利技术的内容是：在富G碱基DNA序列的3’端修饰胞嘧啶，在含100mM钾离子的缓冲液中95℃加热5min，退火形成分子内G四链体结构，然后将该结构和血红素混合，形成高活性G四链体DNA酶。本专利技术通过以下技术方案来实现：(1)如图1所示，在含有四段连续3个G碱基的DNA单链3’端修饰胞嘧啶碱基，在含100mM钾离子的缓冲液中95℃加热5分钟，冷却至室温，形成分子内G四链体结构。(2)将形成的G四链体和hemin混合，在室温下温育0.5小时，形成高活性G四链体DNA酶(图2)。(3)通过改变胞嘧啶的修饰基团，调节其嘧啶环上的电荷密度，利用DNA酶催化H2O2-ABTS(2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)反应，用分光光度法监测其不同碱基突变下的催化活性。与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：本专利技术将不同胞嘧啶衍生物修饰在富G碱基序列的末端，形成的G四链体结合hemin构建形成G四链体DNA酶，间位上的胞嘧啶能够显著提高DNA酶的催化活性，同时修饰后的基团为胞嘧啶提供电荷，进一步激活DNA酶的催化活力。相对于现有DNA酶，具有以下特点：(1)该DNA酶具有合成过程简单、价格低廉、易于保存、激活位点明晰的优点。(2)该DNA酶在间位胞嘧啶的激活下具有高的催化活性，修饰之后可以进一步提高活性，达到与天然酶相同数量级的酶活性。(3)间位胞嘧啶可以在常温下达到Kcat＝1.72s-1的催化活性；氮杂胞苷的修饰可以进一步提高了催化活性，达到kcat＝22.7s-1，该活性与天然酶处于同个数量级。四、附图说明图1.末端修饰胞嘧啶的富G碱基序列(四段连续的3个G碱基)在钾离子辅助下形成了分子内G四链体结构的示意图图2.高活性G四链体DNA酶的形成以及不同间位胞嘧啶衍生物激活催化活性的示意图五、具体实施方式实施例1：结合附图1，说明分子内G四链体结构的形成3’端修饰胞嘧啶的富G碱基DNA序列，在含有100mM钾离子的Britton-Robinson(B-R)缓冲液中(10mM缓冲液，pH7.0)95℃加热5分钟后，缓慢退火至室温，形成分子内G四链体结构。实施例2：结合附图2，利用圆二色光谱，热差谱等技术说明分子内G四链体的形成，与hemin结合成DNA酶后，利用分光光度计测试其催化H2O2-ABTS的反应速率。(1)酶溶液的制备：将形成的分子内G四链体结构和hemin混合在含100mMK+，0.05％TritonX-100和1％DMSO的10mMB-R缓冲液(pH7.0)中，最终浓度分别为0.4μM和0.8μM，室温孵育0.5小时。(2)控制酶溶液的温度在25℃之间，加入0.6mMABTS，然后用0.1-10mMH2O2触发反应，用分光光度法监测其酶反应动力学1min，获得其反应初始速率之后，利用米氏模型进行拟合，获得其米氏常数，研究酶的催化活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间位胞嘧啶增强催化活性且可通过修饰胞嘧啶实现高催化活性G四链体DNA酶的策略。其特征在于该酶是利用单端修饰胞嘧啶碱基的富G碱基DNA序列在含100mM钾离子的缓冲液中，95℃加热5min，退火冷却形成分子内G四链体结构，与血红素结合而形成DNA酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种间位胞嘧啶增强催化活性且可通过修饰胞嘧啶实现高催化活性G四链体DNA酶的策略。其特征在于该酶是利用单端修饰胞嘧啶碱基的富G碱基DNA序列在含100mM钾离子的缓冲液中，95℃加热5min，退火冷却形成分子内G四链体结构，与血红素结合而形成DNA酶。


2.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于形成酶的DNA序列含有四段连续的3个G碱基，3’端修饰了间位胞嘧啶碱基。


3.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于所述DNA序列在95℃加热5分钟并缓慢退火至室温，形成分子内G四链体结构。


4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，鞠熀先，陈杰林，程明攀，王佳伟，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32