用于切割SSDNA以及检测靶DNA的V型CRISPR/CAS效应蛋白制造技术

提供了用于检测样品中的靶DNA(双链或单链)的组合物和方法。在一些实施方案中，主题方法包括：(a)使所述样品与以下物质接触：(i)V型CRISPR/Cas效应蛋白(例如，Cas12蛋白，诸如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e)；(ii)指导RNA(所述指导RNA包含与所述V型CRISPR/Cas效应蛋白结合的区域和与所述靶DNA杂交的指导序列)；和(iii)检测剂DNA，所述检测剂DNA为单链的(即“单链检测剂DNA”)且不与所述指导RNA的所述指导序列杂交；以及(b)测量(由所述V型CRISPR/Cas效应蛋白)切割所述单链检测剂DNA而产生的可检测信号。还提供了用于例如在细胞内部切割单链DNA(例如，非靶ssDNA)的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于切割SSDNA以及检测靶DNA的V型CRISPR/CAS效应蛋白交叉引用本申请要求2017年11月22日提交的美国临时专利申请号62/590,106、2018年2月5日提交的美国临时专利申请号62/626,593和2018年2月14日提交的美国专利申请号15/897,089的权益，所述申请以引用方式整体并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是根据国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的资助号1244557在政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。引言细菌适应性免疫系统采用CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)和CRISPR相关(Cas)蛋白进行RNA指导的核酸切割。CRISPR-Cas系统由此通过RNA指导的核酸干扰赋予细菌和古细菌中的适应性免疫。为了提供抗病毒免疫，将经加工的CRISPR阵列转录物(crRNA)与含Cas蛋白的监督复合物组装，所述监督复合物识别与crRNA的病毒来源区段(称为间隔序列)具有序列互补性的核酸。2类CRISPR-Cas系统是精简型式，其中与RNA结合的单个Cas蛋白(效应蛋白，例如V型Cas效应蛋白，诸如Cpf1)负责结合和切割靶向序列。这些最小系统的可编程性质有利于它们用作一种多功能技术，这种技术持续变革基因组操纵领域。
技术实现思路
2类CRISPR-Cas系统(例如，V型CRISPR/Cas系统，诸如Cas12家族系统)的特征在于包含单个效应蛋白的效应模块。例如，在V型CRISPR/Cas系统中，效应蛋白-CRISPR/Cas内切核酸酶(例如，Cas12a蛋白)与相应的指导RNA(例如，Cas12a指导RNA)相互作用(结合)以形成核糖核蛋白(RNP)复合物，所述复合物通过指导RNA与靶核酸分子内的靶序列之间的碱基配对被靶向至靶核酸中的特定位点。本公开提供了利用以下发现的组合物和方法：V型CRISPR/Cas蛋白(例如，Cas12蛋白，诸如Cpf1(Cas12a)和C2c1(Cas12b))一旦通过检测到靶DNA而被激活，就会混杂地切割非靶向单链DNA(ssDNA)。一旦V型CRISPR/Cas效应蛋白(例如，Cas12蛋白，诸如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e)被指导RNA激活(在样品包含与指导RNA杂交的靶DNA(即，样品包含靶向DNA)时发生)，该蛋白质就会成为混杂地切割ssDNA(即非靶ssDNA，即指导RNA的指导序列未与之杂交的ssDNA)的核酸酶。因此，当样品中存在靶向DNA(双链或单链)时(例如，在一些情况下超过阈值量)，引起样品中ssDNA的切割，这可使用任何方便的检测方法(例如，使用标记的单链检测剂DNA)加以检测。提供了用于检测样品中的靶DNA(双链或单链)的组合物和方法。在一些情况下，主题方法包括：(a)使样品与以下物质接触：(i)V型CRISPR/Cas效应蛋白(例如，Cas12蛋白，诸如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e)；(ii)指导RNA(其包含与V型CRISPR/Cas效应蛋白结合的区域和与靶DNA杂交的指导序列)；和(iii)检测剂DNA，所述检测剂DNA为单链的(即“单链检测剂DNA”)且不与指导RNA的指导序列杂交；以及(b)测量(由V型CRISPR/Cas效应蛋白)切割单链检测剂DNA而产生的可检测信号。在一些情况下，单链检测剂DNA包含荧光发射染料对(例如，荧光发射染料对是荧光共振能量转移(FRET)对、猝灭剂/荧光剂对)。在一些情况下，靶DNA是病毒DNA(例如，乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、细小病毒等)。还提供了用于切割单链DNA(ssDNA)的组合物和方法。在一些情况下，此类方法包括使核酸群体与以下物质接触，其中所述群体包含靶DNA和多个非靶ssDNA：(i)V型CRISPR/Cas效应蛋白(例如，Cas12蛋白，诸如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e)；和(ii)指导RNA(其包含与V型CRISPR/Cas效应蛋白结合的区域和与靶DNA杂交的指导序列)，其中V型CRISPR/Cas效应蛋白切割所述多个非靶ssDNA。在一些情况下，接触是在诸如真核细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等的细胞的内部(例如，体外、离体、体内)。还提供了用于实施主题方法的组合物(例如，试剂盒)。附图说明图1A-图1E提供各种V型CRISPR/Cas效应蛋白的氨基酸序列(描绘为Cas12a和Cas12b序列)。图2提供示例性指导RNA序列(例如，crRNA重复序列和示例性单指导RNA序列)和示例性PAM序列。图3A-图3B呈现与非互补链切割有关的数据。图4A-图4B呈现与Cas12a的非特异性DNA酶活性有关的数据。图5A-图5B呈现与非靶链切割有关的数据。图6呈现与显示RuvC核酸酶负责ssDNA的反式切割有关的数据。图7呈现与M13噬菌体ssDNA的快速“切碎”有关的数据。图8呈现与使用基于FQ的测定进行的检测有关的数据。图9A-图9B呈现与PAM近端错配有关的数据。图10呈现与转换动力学有关的数据。图11A-图11B呈现与使用主题检测方法区分病毒血清型有关的数据。图12呈现CRISPR-Cas12a切割DNA的图解模型。图13A-图13C呈现显示Cas12a靶标识别激活非特异性单链DNA切割的数据。图13A.靶向dsDNA底物的Cas12a-crRNA复合物的卡通插图，其中切割位点描绘了5’突出交错切口。图13B.靶向环状单链M13DNA噬菌体的纯化LbaCas12a的体外时程揭示了强大的切碎模式。图13C.靶向M13ssDNA噬菌体的纯化SpyCas9的时程。图14A-图14C呈现显示Cas12a反式切割活性需要互补激活剂的数据。图14A.如所示以多种摩尔比与LbaCas12a-crRNA一起孵育的放射性标记的靶dsDNA或图14B)非特异性ssDNA。每个点表示在37C下30分钟后(此时反应完成)的定量切割％。图14C.使用dsDNA或ssDNA激活剂的LbCas12a反式切割的Michaelis-Menten动力学。图15A-图15C呈现显示反式切割激活的特异性涉及PAM识别和DNA解链的数据。图15A.使用指定激活剂在变性PAGE凝胶上的反式切割产物。图15B.使用具有指定错配的ssDNA或dsDNA激活剂观察到的反式切割速率。图15C.LbaCas12a可区分两个密切相关的dsDNAHPV序列。图16A-图16C呈现显示非特异性ssDNA切割活性在V型CRISPR系统中保守的数据。图16A.突出显示指定V型效应蛋白的系统发育树。图16B.描绘V型效应蛋白中，而非II型效应蛋白SpyCas9的激活剂依赖性反式切割的切割凝胶。图16C.PAM依赖性和PAM非依赖性顺式和反式切割激活的模型。图17呈现显示靶链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中的靶DNA的方法，所述方法包括：/n(a)使所述样品与以下物质接触：/n(i)V型CRISPR/Cas效应蛋白；/n(ii)指导RNA，所述指导RNA包含：与所述V型CRISPR/Cas效应蛋白结合的区域和与所述靶DNA杂交的指导序列；和/n(iii)为单链的且不与所述指导RNA的所述指导序列杂交的检测剂DNA；以及/n(b)测量由所述V型CRISPR/Cas效应蛋白切割所述单链检测剂DNA而产生的可检测信号，从而检测所述靶DNA。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171122 US 62/590,106;20180205 US 62/626,593;20181.一种检测样品中的靶DNA的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与以下物质接触：
(i)V型CRISPR/Cas效应蛋白；
(ii)指导RNA，所述指导RNA包含：与所述V型CRISPR/Cas效应蛋白结合的区域和与所述靶DNA杂交的指导序列；和
(iii)为单链的且不与所述指导RNA的所述指导序列杂交的检测剂DNA；以及
(b)测量由所述V型CRISPR/Cas效应蛋白切割所述单链检测剂DNA而产生的可检测信号，从而检测所述靶DNA。


2.如权利要求1所述的方法，其包括使所述样品与前体指导RNA阵列接触，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白切割所述前体指导RNA阵列以产生所述指导RNA和至少一个另外的指导RNA。


3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述靶DNA是单链的。


4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述靶DNA是双链的。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA是病毒DNA。


6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA是乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、腺病毒、痘病毒或细小病毒DNA。


7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas12蛋白。


8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas12a(Cpf1)或Cas12b(C2c1)蛋白。


9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白是Cas12d(CasY)或Cas12e(CasX)蛋白。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述样品包含来自细胞裂解液的DNA分子。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述样品包含细胞。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述接触在体外、离体或体内的细胞内部进行。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶DNA能够以低至200fM的浓度被检测到。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其包括确定所述样品中存在的所述靶DNA的量。


16.根据权利要求15所述的方法，其中所述确定包括：
测量所述可检测信号以生成测试测量值；
测量由参考样品或细胞产生的可检测信号以生成参考测量值；以及
将所述测试测量值与所述参考测量值进行比较，以确定所述样品中存在的靶DNA的量。


17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中测量可检测信号包括以下一项或多项：基于金纳米颗粒的检测、荧光偏振、胶体相变/分散、电化学检测和基于半导体的感测。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述单链检测剂DNA包含荧光发射染料对。


19.根据权利要求18所述的方法，其中在所述单链检测剂DNA被切割之前所述荧光发射染料对产生一定量的可检测信号，并且在所述单链检测剂DNA被切割之后所述可检测信号的量减少。


20.根据权利要求18所述的方法，其中所述单链检测剂DNA在被切割之前产生第一可检测信号，并且在所述单链检测剂DNA被切割之后产生第二可检测信号。


21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述荧光发射染料对是荧光共振能量转移(FRET)对。


22.根据权利要求18所述的方法，其中在所述单链检测剂DNA被切割之后，可检测信号的量增加。


23.根据权利要求18或权利要求22所述的方法，其中所述荧光发射染料对是猝灭剂/荧光剂对。


24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述单链检测剂DNA包含两个或更多个荧光发射染料对。


25.根据权利要求24所述的方法，其中所述两个或更多个荧光发射染料对包括荧光共振能量转移(FRET)对和猝灭剂/荧光剂对。

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·都纳，J·S·陈，L·B·哈灵顿，E·马，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US