用于基因编辑的Cpf1-相关方法和组合物技术

本披露涉及用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列的表达的CRISPR/Cpf1相关方法和组分，以及用于评估这样的编辑和/或表达的调节的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因编辑的Cpf1-相关方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月11日提交的美国临时申请序列号62/597,118、2018年1月29提交的美国临时申请序列号62/623,501、2018年4月30日提交的美国临时申请序列号62/664,905、以及2018年10月16日提交的美国临时申请序列号62/746,494的优先权，对其中的每一个要求优先权并将其各自的内容以其全文结合在此。序列表本说明书进一步通过引用而结合于2018年12月11日经由EFS在此提交的序列表。依照37C.F.R.§1.52(e)(5)，本序列表文本文件标识为0841770210SL.txt，为444,032字节并创建于2018年12月11日。将序列表的整个内容通过引用特此并入。本序列表并未延伸超出本说明书的范围，并且因此不含有新问题。
本披露涉及用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列的表达的CRISPR/Cpf1相关方法和组分，以及用于评估这样的编辑和/或表达的调节的方法和组合物。
技术介绍
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)在细菌和古核生物中作为适应性免疫系统进化，以防御病毒攻击。在暴露于病毒后，病毒DNA的短区段被整合进CRISPR基因座中。RNA是从包括病毒序列的CRISPR基因座的一部分转录。所述RNA含有与病毒基因组互补的序列，介导将Cpf1蛋白靶向病毒基因组中的靶序列。Cpf1蛋白(“来自普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西斯菌属(Franciscella)1的CRISPR”)又称为Cas12a，其又裂解病毒靶标并且由此使所述靶标沉默。最近，CRISPR/Cpf1系统已经改适以用于在真核细胞中进行基因组编辑。位点特异性双链断裂(DSB)的引入允许通过内源DNA修复机制(例如非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))改变靶序列。
技术实现思路
本披露提供了用于编辑靶核酸序列和/或调节靶核酸序列表达的改进的CRISPR/Cpf1相关方法和组分，例如，在治疗上相关的细胞系中和关于治疗上相关的靶序列中，以及用于评估这样的靶标编辑和/或表达调节的效率的策略。在一方面，本披露涉及CRISPR/Cpf1介导的治疗上相关的靶位点的编辑在治疗上相关的细胞群中的用途。例如，但并非进行限制，本披露提供了包括治疗上相关的靶位点的修饰的分离细胞。在某些实施例中，所述细胞是T细胞，例如，CD8+T细胞、CD8+天然T细胞、CD4+中枢记忆T细胞、CD8+中枢记忆T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+T细胞、CD4+干细胞记忆T细胞、CD8+干细胞记忆T细胞、CD4+辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、CD4+天然T细胞、TH17CD4+T细胞、TH1CD4+T细胞、TH2CD4+T细胞、TH9CD4+T细胞、CD4+Foxp3+T细胞、CD4+CD25+CD127-T细胞或CD4+CD25+CD127-Foxp3+T细胞。在某些实施例中，所述细胞是淋巴样祖细胞、造血干细胞(HSC)、人脐带血来源的红系祖(HUDEP)细胞、自然杀伤细胞或树突细胞。在某些实施例中，所述细胞是HSC或HUDEP细胞。在某些实施例中，本披露提供了一种包括修饰，例如破坏(例如在HBG基因座中由包含Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向HBG基因座(例如，包括HBG基因的调控区)的gRNA分子的RNP复合物的递送产生)的分离的细胞或细胞群。在某些实施例中，RNP复合物包括Cpf1RNA指导的核酸酶和gRNA分子之间的复合物。在某些实施例中，可以靶向HBG基因座的任何区域。在某些实施例中，靶向HBG基因的顺式调控区。在某些实施例中，本披露涉及CRISPR/Cpf1介导的HBG基因座的启动子区的编辑(例如破坏)的用途。在某些实施例中，本披露涉及CRISPR/Cpf1介导的HBG基因座的-800至-60nt启动子区(例如-110nt启动子区)的编辑的用途。在某些实施例中，可以编辑(例如破坏)HBG基因座的顺式调控区。例如，但并非进行限制，CRISPR/Cpf1介导的编辑可用于破坏HBG基因座的顺式调控区中存在的CAAT盒。HBG启动子区的普遍性破坏和CAAT盒的特异性破坏可以经由靶向那些序列的CRISPR/Cpf1编辑系统的递送来实现。用于这样的CRISPR/Cpf1编辑系统(靶向HBG基因座的那些序列)中使用的gRNA分子的非限制性实例，在图6、9和11和表19中进行了鉴定。在某些实施例中，靶向HBG基因序列的gRNA分子包含gRNA分子的序列，称为HBG1-1。在某些实施例中，本披露涉及分离的CRISPR/Cpf1编辑的细胞，其中HBG基因座的-110nt启动子区使用复合物进行了破坏，所述复合物包含CRISPR/Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向HBG基因座的-110nt启动子区的指导RNA。在某些实施例中，这样的CRISPR/Cpf1编辑的细胞可以包括CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，这样的CRISPR/Cpf1编辑的细胞不包括CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合用于检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及CRISPR/Cpf1编辑的细胞群，其中HBG基因座的-110nt启动子区使用复合物进行了破坏，所述复合物包含CRISPR/Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向HBG基因座的-110nt启动子区的指导RNA。在某些实施例中，这样的CRISPR/Cpf1编辑的细胞群可以包括包含CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分的细胞。在某些实施例中，这样的CRISPR/Cpf1编辑细胞群不包括CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合用于检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及CRISPR/Cpf1编辑的细胞，其中HBG启动子区中存在的CAAT盒使用复合物进行了破坏，所述复合物包含CRISPR/Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向HBG基因座的启动子区中存在的CAAT盒的指导RNA。在某些实施例中，这样的细胞包含CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分。在某些实施例中，这样的CRISPR/Cpf1编辑的细胞不包括CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分，如使用适合用于检测此类组分的方法确定的。在某些实施例中，本披露涉及CRISPR/Cpf1编辑的细胞群，其中HBG启动子区中存在的CAAT盒使用复合物进行了破坏，所述复合物包含CRISPR/Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向HBG基因座的启动子区中存在的CAAT盒的指导RNA。在某些实施例中，这样的CRISPR/Cpf1编辑的细胞群可以包括包含CRISPR/Cpf1编辑系统的一种或多种组分的细胞。在某些实施例中，本披露提供了一种CRISPR/Cpf1编辑的细胞或使用包括修饰，例如破坏(例如在特异性表达转录抑制因子BCL11a的红系细胞中由包含Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向BCL11a基因序列的gRNA分子的复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含由RNP复合物的递送产生的在HBG基因序列或BCL11a基因序列中的修饰，所述RNP复合物包含来自普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西斯菌属(Franciscella)1(Cpf1)RNA指导的核酸酶的CRISPR和靶向所述HBG基因序列或所述BCL11a基因序列的gRNA分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171211 US 62/597,118;20180129 US 62/623,501;20181.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含由RNP复合物的递送产生的在HBG基因序列或BCL11a基因序列中的修饰，所述RNP复合物包含来自普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西斯菌属(Franciscella)1(Cpf1)RNA指导的核酸酶的CRISPR和靶向所述HBG基因序列或所述BCL11a基因序列的gRNA分子。


2.一种CD34+细胞群或造血干细胞(HSC)细胞群，其中一个或多个细胞包含所述HBG基因的顺式调控区中的破坏，其中所述破坏是使用RNP复合物产生的，所述RNP复合物包含CRISPR/Cpf1RNA指导的核酸酶和靶向所述HBG基因的所述顺式调控区的gRNA。


3.根据权利要求2所述的细胞群，其中所述顺式调控区包括HBG基因启动子的CAAT盒。


4.一种治疗或减轻有需要的受试者中的血红蛋白病症状的方法，所述方法向所述受试者施用根据权利要求2或3所述的细胞群。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞群具有与未经修饰的细胞群相比表达增加的胎儿血红蛋白表达，或在施用之后导致胎儿血红蛋白表达增加，其中，胎儿血红蛋白表达的增加的量适于部分或完全减轻血红蛋白病的症状。


6.一种分离的T细胞，所述分离的T细胞包含由复合物的递送产生的在核酸序列中的修饰，所述复合物包含来自普雷沃菌属和弗朗西斯菌属1(Cpf1)RNA指导的核酸酶的CRISPR和靶向所述核酸序列的gRNA分子，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：FAS基因序列的一部分、BID基因序列的一部分、CTLA4基因序列的一部分、PDCD1基因序列的一部分、CBLB基因序列的一部分、PTPN6基因序列的一部分、B2M基因序列的一部分、TRAC基因序列的一部分、CIITA基因序列的一部分、TRBC基因序列的一部分及其组合。


7.一种T细胞群，所述T细胞群包含选自由TRAC、TRBC、B2M和CIITA组成的组中的一个或多个基因的破坏，其中所述破坏是使用一种或多种RNP复合物产生的，所述RNP复合物包含CRISPR/CPf1RNA指导的核酸酶和靶向选自由TRAC、TRBC、CIITA和B2M组成的组中的基因的gRNA，其中，所述T细胞群中至少60％的T细胞不包含所述T细胞表面上可检测水平的MHCII受体、TCR或B2M。


8.根据权利要求7所述的T细胞群，所述T细胞群进一步包含嵌合抗原受体(CAR)或插入破坏的TRAC基因座的工程化的T细胞受体(eTCR)。


9.根据权利要求6、7或8所述的分离的T细胞或T细胞群，其中所述T细胞是CD8+T细胞、CD8+天然T细胞、CD4+中枢记忆T细胞、CD8+中枢记忆T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+T细胞、CD4+干细胞记忆T细胞、CD8+干细胞记忆T细胞、CD4+辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、CD4+天然T细胞、TH17CD4+T细胞、TH1CD4+T细胞、TH2CD4+T细胞、TH9CD4+T细胞、CD4+Foxp3+T细胞、CD4+CD25+CD127-T细胞或CD4+CD25+CD127-Foxp3+T细胞。


10.一种包含核定位信号(NLS)的来自普雷沃菌属和弗朗西斯菌属1(Cpf1)RNA指导的核酸酶的分离的CRISPR，其中所述Cpf1RNA指导的核酸酶包含在所述核酸酶的N末端处或N末端附近的一个或多个NLS序列，在所述核酸酶的C末端处或C末端附近的一个或多个NLS序列，或在所述核酸酶的N末端和C末端处或N末端和C末端附近的一个或多个NLS序列。


11.根据权利要求10所述的分离的Cpf1RNA指导的核酸酶，其中所述NLS序列选自由以下组成的组：核质蛋白NLS(nNLS)(SEQIDNO:1)和猿猴病毒40“SV40”NLS(sNLS)(SEQIDNO:2)。


12.一种包含半胱氨酸氨基酸的缺失或取代的来自普雷沃菌属和弗朗西斯菌属1(Cpf1)RNA指导的核酸酶的分离的CRISPR，其中所述Cpf1RNA指导的核酸酶在野生型AsCpf1氨基酸序列的C65、C205、C334、C379、C608、C674、C1025或C1248处包含缺失或取代，并且其中所述取代选自由以下组成的组：C65S/A、C205S/A、C334S/A、C379S/A、C608S/A、C674S/A和C1025S/A。


13.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求10-12中任一项所述的Cpf1RNA指导的核酸酶。


14.一种修饰HSC或T细胞群中的一个或多个目的靶序列的方法，所述方法包括使所述细胞群离体或体外地与一种或多种RNP复合物接触，所述RNP复合物包含：
(a)与所述目的靶序列互补的gRNA分子；和
(b)根据权利要求10-12中任一项所述的Cpf1RNA指导的核酸酶，
其中所述一种或多种RNP复合物修饰所述细胞群中的所述一个或多个目的靶序列。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞群中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞包含有效的indel。


16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中所述靶核酸序列选自由以下组成的组：B2M基因序列的一部分、T...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·戈里，J·左瑞斯，H·嘉亚拉穆，
申请(专利权)人：爱迪塔斯医药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US