【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及用于改变靶核酸序列或调节靶核酸序列的表达的基因组编辑系统和方法，以及其与编码血红蛋白亚基的基因的改变和/或血红蛋白病的治疗相关的应用。
技术介绍
1、血红蛋白(hb)将红血球或红细胞(rbc)中的氧气从肺部携带到组织。在产前发育期间直至出生后不久，血红蛋白以胎儿血红蛋白(hbf)，一种由两条alpha(α)-珠蛋白链和两条gamma(γ)-珠蛋白链组成的四聚体蛋白，的形式存在。hbf大部分被成人血红蛋白(hba)，一种四聚体蛋白，替代，其中hbf的γ-珠蛋白链通过称为珠蛋白转换的过程被beta(β)-珠蛋白链替代。成人平均产生的hbf占总血红蛋白的不到1％(thein 2009)。α-血红蛋白基因位于16号染色体上，而β-血红蛋白基因(hbb)、a gamma(aγ)-珠蛋白链(hbg1，也称为γ珠蛋白a)和g gamma(gγ)-珠蛋白链(hbg2，也称为γ珠蛋白g)位于珠蛋白基因簇内的11号染色体上(也称为珠蛋白基因座)。
2、hbb突变可能导致血红蛋白病症(即，血红蛋白病)，所述血红蛋白病症包含镰状细胞病(scd)和β-地中海贫血(β-thal)。美国大约有93,000人被诊断患有血红蛋白病。全球每年有300,000名儿童出生时患有血红蛋白病(angastiniotis 1998)。由于这些病状与hbb突变相关，因此它们的症状通常直到珠蛋白从hbf转换为hba后才会显现。
3、scd是美国最常见的遗传性血液疾病，影响大约80,000人(brousseau 2010)。scd在非洲血统的人中
4、scd是由hbb基因中的单个纯合突变引起的，c.17a>t(hbs突变)。镰状突变是hbb上的点突变(gag>gtg)，引起外显子1中氨基酸位置6处的谷氨酸被缬氨酸取代。β-血红蛋白链的位置6处的缬氨酸是疏水性的，并且当它不与氧结合时，会使β-珠蛋白构象发生变化。这种构象的变化使hbs蛋白在缺氧的情况下聚合，导致rbc变形(即，镰状化)。scd以常染色体隐性方式遗传，使得只有具有两个hbs等位基因的患者才会患有所述疾病。杂合子受试者具有镰状细胞特征，并且如果所述受试者严重脱水或缺氧，可能会出现贫血和/或痛苦危象。
5、镰状rbc会引起多种症状，包含贫血、镰状细胞危象、血管闭塞性危象、再生障碍性危象和急性胸部综合征。镰状rbc的弹性低于野生型rbc的弹性，因此不能轻易穿过毛细血管床并引起闭塞和缺血(即，血管闭塞)。当镰状细胞阻碍器官毛细血管床的血流，导致疼痛、缺血和坏死时，就会发生血管闭塞性危象。这些发作通常持续5-7天。脾脏在清除功能失调的rbc方面发挥着作用，因此通常在儿童早期会肿大，并且经常发生血管闭塞性危象。到儿童末期，scd患者的脾脏常常梗塞，这导致自体脾切除术。溶血是scd的一个持续特征，并且会导致贫血。镰状细胞在循环中存活10-20天，而健康rbc存活90-120天。scd受试者根据需要进行输血以维持足够的血红蛋白水平。频繁输血使受试者有感染hiv、乙型肝炎和丙型肝炎的风险。受试者还可能患有急性胸部危象以及四肢、终末器官和中枢神经系统的梗死。
6、scd受试者的预期寿命会缩短。通过对危象和贫血进行仔细的终身管理，scd患者的预后正在稳步改善。截至2001年，镰状细胞病受试者的平均预期寿命为55-59岁。目前scd的治疗涉及危象期间的水合作用和疼痛管理，以及根据需要输血以纠正贫血。
7、地中海贫血(例如β-thal、δ-thal和β/δ-thal)会导致慢性贫血。据估计，β-thal影响全世界100,000个人中的大约1个。β-thal在某些群体中的患病率较高，包含欧洲血统的群体，其中其患病率为10,000中大约1个。重型β-thal，所述疾病的更严重形式，除非用终身输血和螯合疗法治疗，否则会危及生命。在美国，大约有3,000名重型β-thal受试者。β-thal中间体不需要输血，但可能导致生长延迟和显著的全身异常，并且通常需要终生螯合疗法。尽管hba构成成人rbc中的大部分血红蛋白，但大约3％的成人血红蛋白以hba2，一种hba变体，的形式存在，其中两条γ-珠蛋白链被两条delta(δ)-珠蛋白链替代。δ-thal与导致hbd表达缺失的δ血红蛋白基因(hbd)突变相关。hbd突变的共同遗传可以通过将hba2水平降低到正常范围来掩盖β-thal(即，β/δ-thal)的诊断(bouva 2006)。β/δ-thal通常是由两个等位基因中的hbb和hbd序列缺失引起的。在纯合子(δo/δoβo/βo)患者中，hbg被表达，导致仅产生hbf。
8、与scd一样，β-thal是由hbb基因突变引起的。导致β-thal的最常见hbb突变为：c.-136c>g、c.92+1g>a、c.92+6t>c、c.93-21g>a、c.118c>t、c.316-106c>g、c.25_26delaa、c.27_28insg、c.92+5g>c、c.118c>t、c.135delc、c.315+1g>a、c.-78a>g、c.52a>t、c.59a>g、c.92+5g>c、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-78a>g、c.52a>t、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-138c>t、c.-79a>g、c.92+5g>c、c.75t>a、c.316-2a>g和c.316-2a>c。这些和其它与β-thal相关的突变会导致β-珠蛋白链突变或不存在，从而导致正常hbα-血红蛋白与β-血红蛋白的比率被破坏。过量的α-珠蛋白链沉淀在骨髓中的红系前体中。
9、在重型β-thal中，hbb的两个等位基因都含有导致β-珠蛋白完全不存在(表示为β0/β0)的无义、移码或剪接突变。重型β-thal引起β-珠蛋白链严重减少，导致rbc中α-珠蛋白链显著沉淀和更严重的贫血。
10、β-thal中间体是由hbb的5'或3'非翻译区突变、hbb启动子区域或多腺苷酸化信号突变或hbb基因内剪接突变产生的。患者基因型表示为βo/β+或β+/β+。βo表示β-珠蛋白链的表达不存在；β+表示功能失调但存在的β-珠蛋白链。表型表达因患者而异。由于产生了一些β-珠蛋白，β-thal中间体引起红系前体中α-珠蛋白链的沉淀较少，并且贫血比重型β-thal更轻。然而，继发于慢性贫血的红系谱系扩张具有更显著的后果。
11、重型β-thal受试者的年龄在6个月至2岁之间，并且患有生长迟缓、发烧、肝脾肿大和腹泻。充分的治疗包含定期输血。重型β-thal的疗法还包本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种减轻有需要的受试者的β-地中海贫血(β-Thal)的一种或多种症状的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA延伸部包括选自由SEQ ID NO:1235-1250组成的组的序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶向结构域包括表7、8、11和12中所示的序列或由所述序列组成。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述靶位点包括位于Chr 11(NC_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；Chr 11(NC_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述Cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型Cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型Cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(NLS)、一种或多种纯化标签和其组合。
6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述Cpf1包括选自由SEQ ID NO:1000、1001、
7.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述Cpf1包括选自由SEQ ID NO:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。
8.根据权利要求1至7所述的方法，其中使用电穿孔将所述RNP复合物递送到所述细胞。
9.一种诱导来自β-地中海贫血(β-Thal)受试者的CD34+或造血干细胞群体中的血红蛋白(Hb)表达的方法，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述gRNA包括DNA延伸部，所述DNA延伸部包括选自由SEQ ID NO:1235-1250组成的组的序列。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述gRNA靶向结构域包括表7、8、11和12中所示的序列或由所述序列组成。
12.根据权利要求9至11所述的方法，其中所述gRNA包括靶向结构域，所述靶向结构域与HBG基因的所述启动子中的靶位点互补，其中所述靶位点包括位于Chr 11(NC_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；Chr 11(NC_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。
13.根据权利要求9至12所述的方法，其中所述RNP复合物包括Cpf1，所述Cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型Cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型Cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(NLS)、一种或多种纯化标签和其组合。
14.根据权利要求9至13所述的方法，其中所述Cpf1包括选自由SEQ ID NO:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。
15.根据权利要求9至14所述的方法，其中所述Cpf1包括选自由SEQ ID NO:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。
16.根据权利要求9至15所述的方法，其中使用电穿孔将所述RNP复合物递送到所述细胞。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种减轻有需要的受试者的β-地中海贫血(β-thal)的一种或多种症状的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna延伸部包括选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶向结构域包括表7、8、11和12中所示的序列或由所述序列组成。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述靶位点包括位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。
6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述cpf1包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。
7.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述cpf1包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。
8.根据权利要求1至7所述的方法，其中使用电穿孔将所述rnp复合物递送到所述细胞。
9.一种诱导来自β-地中海贫血(β-thal)受试者的cd34+或造血干细胞群体中的血红蛋白(hb...
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