【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于编辑靶核酸序列或调控靶核酸序列表达的crispr/cas相关方法和组分，及其与包括镰状细胞病和β-地中海贫血的β-血红蛋白病的结合应用。
技术介绍
1、血红蛋白(hb)将氧气从肺部携带到红细胞或红血细胞(rbc)中的组织。在胚胎发育期间和出生后不久，血红蛋白以胎儿血红蛋白(hbf)的形式存在，胎儿血红蛋白是由两个α-珠蛋白链和两个γ-珠蛋白链组成的四聚体蛋白质。hbf在很大程度上被成人血红蛋白(hba)替换，成人血红蛋白是一种四聚体蛋白质，其中hbf的γ-珠蛋白链通过称为珠蛋白转换的过程被β-珠蛋白链替换。hbf在携带氧气方面比hba更有效。普通成人的总血红蛋白小于1％的hbf(thein 2009)。α-血红蛋白基因位于16号染色体上，而β-血红蛋白基因(hbb)、γ(γa)-珠蛋白链(hbg1，也称为γ珠蛋白a)和gγ(γg)-珠蛋白链(hbg2，也称为γ珠蛋白g)位于珠蛋白基因簇内的11号染色体上(即，珠蛋白基因座)。
2、hbb的突变可引起血红蛋白障碍(即，血红蛋白病)，包括镰状细胞病(scd)和β-地中海贫血(β-thal)。美国大约93,000人被诊断患有血红蛋白病。全球每年有300,000儿童出生患有血红蛋白病(angastiniotis 1998)。因为这些病症与hbb突变有关，所以他们的症状典型地直到珠蛋白从hbf转换为hba后才表现。
3、scd是美国最常见的遗传性血液病，影响大约80,000人(brousseau 2010)。scd在非洲血统的人中最常见，scd的流
4、scd由hbb基因中的单个纯合突变引起，c.17a>t(hbs突变)。镰状突变是hbb上的点突变(gag→gtg)，其导致缬氨酸取代外显子1中氨基酸位置6的谷氨酸。β-血红蛋白链位置6的缬氨酸是疏水性的，并且当β-珠蛋白不与氧气结合时，引起β-珠蛋白构象的变化。这种构象变化引起hbs蛋白在没有氧的情况下聚合，导致rbc变形(即，镰状)。scd以常染色体隐性方式遗传，因此只有具有两个hbs等位基因的患者才患有所述疾病。杂合的受试者具有镰状细胞性状，如果他们严重脱水或缺氧，可能患有贫血和/或痛性危象。
5、镰状形状的rbc引起多种症状，包括贫血、镰状细胞危象、血管阻塞性危象，再生障碍性危象和急性胸部综合征。镰状形状的rbc比野生型rbc弹性小，因此不能容易地通过毛细血管床并导致阻塞和缺血(即，血管阻塞)。当镰状细胞阻塞器官毛细血管床中的血流导致疼痛、缺血和坏死时，就会发生血管阻塞性危象。这些发作典型地持续5天至7天。脾脏在清除功能失调的rbc中起作用，因此典型地在儿童早期期间扩大并且频繁发生血管阻塞性危象。到儿童期结束时，scd患者的脾经常梗塞，导致自体脾切除。溶血是scd的一个恒定特征并引起贫血。镰状细胞在循环中存活10天至20天，而健康的rbc存活90天至120天。必要时输血scd受试者以维持足够的血红蛋白水平。频繁的输血使受试者有感染hiv、乙型肝炎、和丙型肝炎的风险。受试者还可能患有急性胸部危象和四肢、终末器官、和中枢神经系统的梗塞。
6、患有scd的受试者的生命期望降低。通过对危象和贫血进行认真的，终身的管理，scd患者的预后正在稳定地改进。在2001年，患有镰状细胞病的受试者的平均生命期望是50岁中后期。目前对scd的治疗涉及危象期间的水合和疼痛管理，以及根据需要进行输血以校正贫血。
7、地中海贫血(例如，β-thal、δ-thal、和β/δ-thal)引起慢性贫血。估计β-thal影响全球大约100,000人中有1人。它在某些群体中的流行率较高，包括欧洲后裔的群体，其流行率大约为10,000人中有1人。除非通过终身输血和螯合疗法治疗，否则重型β-thal是疾病的更严重形式，是危及生命的。在美国，大约有3,000名患有重型β-thal的受试者。中间型β-thal不需要输血，但可能引起生长延迟和显著的全身异常，并且频繁地需要终身螯合疗法。尽管hba构成成人rbc中大多数血红蛋白，但大约3％的成人血红蛋白是hba2形式，hba变体是两个γ-珠蛋白链被两个δ(δ)-珠蛋白链替换。δ-thal与引起hbd表达损失的δ血红蛋白基因(hbd)突变有关。hbd突变的共遗传可以通过将hba2水平降低至正常范围来掩盖β-thal(即，β/δ-thal)的诊断(bouva 2006)。β/δ-thal通常由两个等位基因中hbb和hbd序列的缺失引起。在纯合的(δo/δoβo/βo)患者中，表达hbg，导致单独产生hbf。
8、与scd一样，β-thal是由hbb基因突变引起的。导致β-thal的最常见的hbb突变是：c.-136c>g、c.92+1g>a、c.92+6t>c、c.93-21g>a、c.118c>t、c.316-106c>g、c.25_26delaa、c.27_28insg、c.92+5g>c、c.118c>t、c.135delc、c.315+1g>a、c.-78a>g、c.52a>t、c.59a>g、c.92+5g>c、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-78a>g、c.52a>t、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-138c>t、c.-79a>g、c.92+5g>c、c.75t>a、c.316-2a>g、和c.316-2a>c。与β-thal有关的这些和其他突变引起β-珠蛋白链的突变或缺失，这导致正常hbα-血红蛋白与β-血红蛋白比率的破坏。过量的α-珠蛋白链在骨髓中的红系前体中沉淀。
9、在重型β-thal中，hbb的两个等位基因都含有无意义突变、移码突变、或剪接突变，导致完全不存在β-珠蛋白产生(表示为βo/βo)。重型β-thal导致β-珠蛋白链的严重减少，导致红系细胞中α-珠蛋白链的显著沉淀和更严重的贫血。
10、中间型β-thal由hbb的5′或3'非翻译区域突变、启动子区域突变、或hbb多聚腺苷酸化信号或hbb基因内的剪接突变导致。患者基因型表示为βo/β+或β+/β+。βo代表不存在β-珠蛋白链的表达；β+代表功能失调但存在的β-珠蛋白链。表型表达因患者而异。由于存在一些β-珠蛋白的产生，中间型β-thal导致红系前体中α-珠蛋白链的沉淀较少，并且与重型β-thal相比导致较少的严重贫血。然而，继发于慢性贫血的红系谱系扩增有更显著的后果。
11、具有重型β-thal的受试者存在于6个月和2岁之间，并且患有未能茁壮成长、发热、肝脾大和腹泻。足够的治疗包括定期输血。重型β-thal疗法还包括脾切除术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向结构域，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。
2.一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向结构域，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列，其中所述靶向结构域包含与SEQ ID NO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同或相差不超过1、2、3、4、或5个核苷酸的核苷酸序列。
3.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含：(a)编码包含靶向结构域的gRNA分子的核苷酸序列，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列，其中所述gRNA分子是如权利要求1或2所述的gRNA分子。
4.一种组合物，所述组合物包含(a)如权利要求1或2所述的gRNA分子。
5.一种改变细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与以下接触：
6.一种治疗有需要的受试者中的β-血红蛋白病的方法，所述方法包括使所述受试者或来自所述受试者的细
7.一种反应混合物，所述反应混合物包含：
8.一种试剂盒，所述试剂盒包含，
9.一种基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含：
...【技术特征摘要】
1.一种grna分子，所述grna分子包含靶向结构域，所述靶向结构域包含与完全或部分位于hbg1或hbg2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。
2.一种grna分子，所述grna分子包含靶向结构域，所述靶向结构域包含与完全或部分位于hbg1或hbg2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列，其中所述靶向结构域包含与seq id no:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同或相差不超过1、2、3、4、或5个核苷酸的核苷酸序列。
3.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含：(a)编码包含靶向结构域的grna分子的核苷酸序列，所述靶向结构域包含...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·L·戈里，L·A·巴雷拉，
申请(专利权)人：爱迪塔斯医药公司，
类型：发明
国别省市：
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