【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法。
技术介绍
1、土壤微生物是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，严格意义上应包括细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。土壤微生物的研究方法经历了从微生物纯培养、土壤酶活性（biolog微平板分析）、微生物库（如微生物生物量）和流（c和n循环），到微生物生物标记物（fames）、微生物分子生物学技术（从土壤中提取dna，进行pcr-dgge、pcr-sscp、rlfp分析等）的发展，揭示了土壤微生物群落丰富的多样性和生态功能。
2、在利用微生物分子生物学技术进行土壤微生物研究时，高质量提取土壤微生物基因组dna是高通量测序检测土壤中微生物组成的重要前提。然而土壤样品成分复杂，往往导致基因组dna提取率低、纯度差，尤其是当土壤中含有大量的腐殖酸时，腐殖酸易与dna结合一同被沉淀下来，影响后续的实验操作，如pcr、高通量测序等。目前提取土壤微生物基因组dna的方法很多，商品化的试剂盒是主流方法，但是一般试剂盒所能处理的土壤样品量较少，大多为0.25~1.0g。从小质量土壤样品中提取的微生物基因组dna并不能有效反映土壤中实际微生物的组成，容易造成部分频率低、丰度小的微生物漏检。
技术实现思路
1、针对现有土壤微生物基因组dna的提取方法处理的土壤样本量小、容易造成部分频率低、丰度小的微生物漏检的
2、一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，包括：
3、（1）向提取容器中加入土壤样品、研磨珠和提取缓冲液，混合振荡，得到初步裂解液；
4、（2）加入sds后加热裂解，得到二次裂解液；
5、（3）离心获取第一上清液，蛋白除杂后再次离心获得第二上清液；
6、（4）加入沉淀试剂混匀，获得dna沉淀物；
7、（5）漂洗后用te缓冲液进行溶解，纯化后获得土壤微生物基因组dna。
8、进一步的，土壤样品为林下土、盐碱土、稻田土、果园土、设施大棚土中的一种。
9、进一步的，步骤（1）中，提取缓冲液包括如下组分：1.0~2.0mol·l-1nacl、质量浓度1%~2% ctab、0.1mol·l-1edta、0.1mol·l-1tris-hcl、0.095mol·l-1na2hpo4、0.005mol·l-1nah2po4，提取缓冲液的ph为8.0~8.5；研磨珠具体为直径1mm的玻璃珠和直径5mm的氧化锆珠。
10、进一步的，步骤（1）中，土壤样品和提取缓冲液的质量体积比为1:1，提取容器与土壤样品的体积质量比为5~10:1，混合振荡具体为37℃、180rpm水平振荡1h。
11、进一步的，步骤（2）中，sds的加入量为土壤样品质量的2%~4%，加热裂解具体为65℃下裂解1.5h。
12、进一步的，步骤（3）中，蛋白除杂具体为：取全部或部分第一上清液，加入等体积的预冷的氯仿，温和颠倒混匀。
13、进一步的，步骤（4）中，沉淀试剂包括质量浓度15%~25%的peg8000溶液和2.0~2.5mol·l-1的nacl溶液，peg8000溶液的加入量为第二上清液体积的1/3，nacl溶液的加入量为第二上清液体积的1/3。
14、进一步的，步骤（5）中，漂洗使用的漂洗液为体积分数70%~80%的乙醇溶液，纯化使用纯化试剂盒，优选为qiagen公司的dneasy® power clean® pro cleanup kit。
15、进一步的，步骤（1）中，在提取之前，向土壤样品加入内参大肠杆菌，用于后续土壤基因组dna提取率的检测，所用检测方法为实时荧光定量pcr检测方法。
16、进一步的，向土壤样品加入内参大肠杆菌的方法为：将内参大肠杆菌在氨苄抗性lb平板上活化后，挑取单菌落于氨苄lb试管中，37℃、180rpm振荡过夜，取少量菌液进行显微镜计数，以1.0×104cfu/g土的用量与待提取微生物基因组dna的土壤样品进行充分混匀，晾干，冻存于-20℃备用。
17、进一步的，内参大肠杆菌的内参质粒所含目的基因为spark基因。
18、本专利技术的有益效果在于：
19、1、本专利技术提供的大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，适用于大质量的各种类型的土壤样品，能有效去除腐殖酸等难去除的杂质，提取率可达到85%，可获得大片段基因组dna（＞20kb），其纯度指标od260/od280＞1.8，od260/od230＞1.6，可直接进行pcr及高通量测序等分子操作。
20、2、采用本专利技术提供的大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，通过对不同质量的土壤样品进行微生物基因组dna提取、测序分析，发现大质量土壤样品（100g、50g）的细菌otu丰度显著高于小质量土壤样品（0.25g、1.0g、10g），50~100g的土壤样本更能满足土壤微生物检测的实际需要。
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1.一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤（1）中，提取缓冲液包括如下组分：1.0~2.0mol·L-1 NaCl、质量浓度1%~2% CTAB、0.1mol·L-1EDTA、0.1mol·L-1 Tris-HCl、0.095mol·L-1 Na2HPO4、0.005mol·L-1 NaH2PO4，提取缓冲液的pH为8.0~8.5；研磨珠具体为直径1mm的玻璃珠和直径5mm的氧化锆珠。
3.如权利要求1或2所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤（1）中，土壤样品和提取缓冲液的质量体积比为1:1，提取容器与土壤样品的体积质量比为5~10:1，混合振荡具体为37℃、180rpm水平振荡1h。
4.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤（2）中，SDS的加入量为土壤样品质量的2%~4%，加热裂解具体为65℃下裂解1.5h。
5.如权利要求1所述的一种大质量土
6.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤（4）中，沉淀试剂包括质量浓度15%~25%的PEG8000溶液和2.0~2.5mol·L-1的NaCl溶液，PEG8000溶液的加入量为第二上清液体积的1/3，NaCl溶液的加入量为第二上清液体积的1/3。
7.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于步骤（5）中，漂洗使用的漂洗液为体积分数70%~80%的乙醇溶液，纯化使用纯化试剂盒。
8.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤（1）中，在提取之前，向土壤样品加入内参大肠杆菌，内参大肠杆菌含有内参质粒。
9.如权利要求8所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，向土壤样品加入内参大肠杆菌的方法为：将内参大肠杆菌在氨苄抗性LB平板上活化后，挑取单菌落于氨苄LB试管中，37℃、180rpm振荡过夜，取少量菌液进行显微镜计数，以1.0×104CFU/g土的用量与待提取微生物基因组DNA的土壤样品进行充分混匀，晾干，冻存于-20℃备用。
10.如权利要求8所述的一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，内参大肠杆菌的内参质粒所含目的基因为Spark基因。
...【技术特征摘要】
1.一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，其特征在于，步骤（1）中，提取缓冲液包括如下组分：1.0~2.0mol·l-1 nacl、质量浓度1%~2% ctab、0.1mol·l-1edta、0.1mol·l-1 tris-hcl、0.095mol·l-1 na2hpo4、0.005mol·l-1 nah2po4，提取缓冲液的ph为8.0~8.5；研磨珠具体为直径1mm的玻璃珠和直径5mm的氧化锆珠。
3.如权利要求1或2所述的一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，其特征在于，步骤（1）中，土壤样品和提取缓冲液的质量体积比为1:1，提取容器与土壤样品的体积质量比为5~10:1，混合振荡具体为37℃、180rpm水平振荡1h。
4.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，其特征在于，步骤（2）中，sds的加入量为土壤样品质量的2%~4%，加热裂解具体为65℃下裂解1.5h。
5.如权利要求1所述的一种大质量土壤样品微生物基因组dna提取方法，其特征在于，步骤（3）中，蛋白除杂具体为：取全部或部分第一上清液，加入等体积的预冷的氯仿，温和颠倒混匀。
6.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：李红梅，魏艳丽，扈进冬，杨翰，杨凯，吴远征，王贻莲，赵忠娟，李纪顺，
申请(专利权)人：山东省科学院生态研究所山东省科学院中日友好生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：
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