【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般涉及分子生物学。更具体地，在一些实施方案中，本专利技术涉及用于定量或单碱基分辨率分析有限生物样品中的dna甲基化(5-甲基胞嘧啶，5mc)的组合物和方法，所述有限生物样品包括来自低细胞数细胞或单细胞的dna和来自血液或其他体液样品的无细胞dna(cfdna)，所述方法在全基因组扩增过程中或在通过定量pcr或高通量测序检测之前扩增特定dna片段或基因座的过程中使用与链置换dna聚合酶偶联的dnmt1，以保存5mc信息。
技术介绍
1、胞嘧啶-鸟嘌呤(cpg)二核苷酸中胞嘧啶碱基的基因组甲基化是涉及细胞类型特异性转录模式调节的关键表观遗传机制。因此，以单碱基分辨率绘制dna甲基化组的图谱为表观遗传调控在发育和疾病中的参与提供了许多有力的见解。由于给定群体内细胞的甲基化谱之间通常具有显著的差异程度，来自大量组织样品的信息可能无法解释由细胞间变异引起的表观基因组的组织异质性；因此，大量数据可能掩盖单个细胞对生化过程的不同贡献。因此，以高准确度和cpg覆盖率进行单细胞全甲基化组分析的能力将能够对大量样品进行反卷积，以更深入地研究dna甲基化发挥作用的各种生物活性，包括但不限于早期胚胎发育和细胞分化、诱导多能干细胞的产生、癌症进展和转移、免疫宿主防御反应和神经元可塑性。
2、另一方面，源自癌症患者肿瘤的血浆中的循环cfdna的发现为基于血液的非侵入性癌症检测测试开辟了新的途径。然而，由于从血浆中提取的cfdna的经降解的小尺寸和低浓度，cfdna中的5mc模式的表征在技术上的要求一直很苛刻。因此，可测量有限细胞数或
3、目前用于绘制基因组甲基化图谱的最广泛使用的技术是全基因组亚硫酸氢盐测序，其提供胞嘧啶甲基化的单碱基分辨率，同时覆盖范围广泛，涵盖人类基因组中近2900万个cpg位点的90％以上。然而，虽然常规的亚硫酸氢盐处理程序能够实现有效的甲基化图谱绘制，但它们同时引发了目标样品的广泛降解，因此需要微克量的输入dna。因此，标准的全基因组亚硫酸氢盐测序很难扩展到少量细胞的水平或用于单细胞分析。例如，lorthongpanich等人(2013)完全避免了亚硫酸氢盐处理，而是将甲基化特异性限制酶与定量pcr结合。虽然该技术能够测量单个细胞中的dna甲基化，但其适用性仅限于几十种候选cpg。guo等人(2013)在单个细胞中证明了一种结合亚硫酸氢盐测序法和限制酶处理的更有效的方法，称为还原型亚硫酸氢盐测序(rrbs)。尽管这样的工作流程更有前景，但仅证明了有限的50到100万个cpg位点的覆盖率。最近，smallwood等人(2014)将单细胞分析改编为一种改良亚硫酸氢盐测序方案，其采用后亚硫酸氢盐衔接子标记，通过预扩增步骤延伸，最终实现每个细胞约20％的cpg覆盖率。虽然用报道的方法获得的cpg覆盖率可以提高到48.4％，但这需要使用导致高pcr重复率的深度测序，并组合从两个不同细胞的基因组dna获得的序列数据。此外，文献中尚未建立用于对无细胞dna的皮克级样品进行彻底和简便的全基因组甲基化分析的可靠方案。因此，在扩增基因组dna或cfdna的同时使它们保持甲基化状态的能力对于进行涉及单个细胞或微量起始dna量的表观基因组学研究是至关重要的。
技术实现思路
1、提供了专门设计用于通过利用扩增步骤来扩大dna样品的有限扩增来解决低原料量的问题的试剂盒、组合物和方法，其中保留5mc信息是关键方面。如实施例中所示，在一些实施方案中，使用dna甲基转移酶以及链置换dna聚合酶以实现扩增的半甲基化产物的同时dna扩增和甲基化，从而产生完全甲基化的产物。
2、此外，本文显示了这些实施方案针对有限量的不同生物样品的广泛和各种适用性，这些生物样品包括少量纯化的人类基因组dna、来自少量或单个人类细胞的dna、和从人类血液或其他体液中纯化的无细胞dna。根据用于初始处理的各个方案和针对这些不同样品而调整的条件进行开发。
3、在其他实施方案中，提供：扩增目标dna分子同时保留5mc信息的方法，该方法包括：使目标dna分子变性以除去二级结构的步骤、与产生产物时通过dna甲基转移酶向半甲基化产物中加入5mc的过程相偶联的全基因组扩增步骤、纯化产物以提取扩增的具有从原料中如实地复制的5mc信息的dna的步骤。
4、其他实施方案包括如前一段所述扩增5mc dna，然后对产物dna进行超声处理，并使用5mc抗体或甲基-cpg结合蛋白来富集dna片段，例如使用来自thermofisher的methylminertm甲基化dna富集试剂盒，并通过下游qpcr或高通量测序来分析的方法。
5、在另一个实施方案中，存在如段落[0009]中所述的扩增5mc dna，然后进行亚硫酸氢盐处理和随后的纯化，例如使用来自zymo的ez dna methylation-directtm试剂盒，并使用基因特异性引物通过pcr和sanger测序进行分析以研究单个基因的甲基化状态，或进行亚硫酸氢盐文库构建和高通量测序，例如使用来自illumina的truseq dna甲基化试剂盒的方法。
6、在另一个实施方案中，存在如段落[0009]中所述的扩增5mc dna，在此之前进行从含有细胞群的样品中提取单细胞或少量细胞的步骤，以及破碎细胞膜以暴露dna内容物用于直接下游扩增的细胞裂解步骤的方法。
7、在另一个实施方案中，存在如段落[0009]中所述的扩增5mc dna，在此之前进行从人血液或其他体液样品中提取cfdna的步骤，在扩增步骤之前定量和计算精确的酶比例和用量的方法。
8、在另一个实施方案中，存在如段落[0009]中所述的扩增5mc dna，在扩增步骤期间还向其中掺入引发酶的方法。引发酶具有合成dna引物的强效活性。引发酶的一个实例是嗜热栖热菌(thermus thermophilus)(tth)primpol。在实施方案中，引发酶降低了在引发步骤期间可能引入的偏差并且使得能够接近完全的全基因组扩增。
9、此外，除了全基因组扩增之外，还有一些方法应用5mc保留系统以用相应的引物扩增特定基因座，并获得特定片段的甲基化信息。这对于扩增具有大量甲基化的特定基因座尤其重要。在一些实施方案中，可以用简单的检测方法例如elisa检测扩增产物与对照。应用包括新生儿筛查或涉及一些疾病中基因座特异性甲基化的其他筛查。
10、在另一个实施方案中，存在一种扩增5mc dna的方法，其类似于段落[0009]中所述，添加针对特定目标区域的相应引物，在此之前进行从人组织、血液或其他体液样品中提取基因组dna的步骤，然后进行甲基化水平的纯化和定量，例如使用酶联免疫吸附测定(elisa)。
11、存在涉及物理加工或操纵甲基化dna以便评估或分析特定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种扩增目标甲基化基因组DNA的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中聚合酶单位与甲基转移酶单位的比例为约1:5至约1:20。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述比例为约1单位:15单位。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与聚合酶和甲基转移酶一起孵育的目标基因组甲基化DNA的量为约5皮克(pg)至约1微克(μg)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述目标基因组甲基化DNA获自组织样品、血清样品、血液样品、粪便样品、尿液样品、或面颊或口腔拭子。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中变性涉及碱性变性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合酶为链置换聚合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚合酶为Phi29或其衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述甲基转移酶可以在半甲基化DNA上安置5mC以达到完全甲基化状态。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述甲基转移酶是DNMT1
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括将所述目标甲基化基因组DNA与包含引发酶和聚合酶双重活性的酶一起孵育，以在复制目标甲基化基因组DNA并产生扩增的基因组甲基化DNA分子的条件期间合成引物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶来自嗜热栖热菌。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤b)的孵育之前，制备单独的主混合物以及包含聚合酶和甲基转移酶的酶混合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含具有引发酶和聚合酶双重活性的酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述酶来自嗜热栖热菌。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶混合物还包含甲基辅因子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述甲基辅因子是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含dNTP、DNA缓冲液和镁。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中在将主混合物与酶混合物混合之前，将目标基因组甲基化DNA和随机引物加入到主混合物中。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括在步骤b)的孵育开始超过3小时后加入更多的甲基辅因子。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其还包括使聚合酶和/或甲基转移酶失活。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述基因组甲基化DNA分子来自人类患者。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其还包括用亚硫酸氢盐处理经分离的复制的甲基化DNA分子。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其还包括对复制的目标甲基化DNA分子进行测序。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，检测或鉴定经分离的复制的甲基化DNA分子中的5-甲基胞嘧啶。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其还包括从患者获得包含基因组甲基化DNA的生物样品。
27.根据权利要求26所述的方法，其中来自患者的生物样品是组织样品、血液或血清样品、粪便样品、尿液样品、或面颊或口腔拭子。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其还包括使扩增的基因组甲基化DNA分子变性。
29.根据权利要求28所述的方法，其中使扩增的基因组DNA分子变性包括对扩增的基因组甲基化DNA分子进行超声处理。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其还包括富集经变性的扩增的基因组甲基化DNA分子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中富集经变性的扩增的基因组甲基化DNA分子涉及5mC抗体或甲基-CpG结合蛋白。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其还包括分析所富集的经变性的扩增的基因组甲基化DNA分子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中分析所富集的经变性的扩增的基因组甲基化DNA分子涉及定量PCR、测序或基于阵列的分析。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其还包括使用特定针对目标基因组区域的至少一对引物对一个或多于一个目标基因组区域进行扩增和/或测序。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其还包括由扩增的基因组甲基化DNA分子制备文库。
36.根据权利要求1至34...
【技术特征摘要】
1.一种扩增目标甲基化基因组dna的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中聚合酶单位与甲基转移酶单位的比例为约1:5至约1:20。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述比例为约1单位:15单位。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与聚合酶和甲基转移酶一起孵育的目标基因组甲基化dna的量为约5皮克(pg)至约1微克(μg)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述目标基因组甲基化dna获自组织样品、血清样品、血液样品、粪便样品、尿液样品、或面颊或口腔拭子。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中变性涉及碱性变性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合酶为链置换聚合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚合酶为phi29或其衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述甲基转移酶可以在半甲基化dna上安置5mc以达到完全甲基化状态。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述甲基转移酶是dnmt1。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括将所述目标甲基化基因组dna与包含引发酶和聚合酶双重活性的酶一起孵育，以在复制目标甲基化基因组dna并产生扩增的基因组甲基化dna分子的条件期间合成引物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶来自嗜热栖热菌。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤b)的孵育之前，制备单独的主混合物以及包含聚合酶和甲基转移酶的酶混合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含具有引发酶和聚合酶双重活性的酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述酶来自嗜热栖热菌。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶混合物还包含甲基辅因子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述甲基辅因子是s-腺苷甲硫氨酸(sam)。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述主混合物包含dntp、dna缓冲液和镁。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中在将主混合物与酶混合物混合之前，将目标基因组甲基化dna和随机引物加入到主混合物中。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括在步骤b)的孵育开始超过3小时后加入更多的甲基辅因子。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其还包括使聚合酶和/或甲基转移酶失活。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述基因组甲基化dna分子来自人类患者。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其还包括用亚硫酸氢盐处理经分离的复制的甲基化dna分子。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其还包括对复制的目标甲基化dna分子进行测序。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，检测或鉴定经分离的复制的甲基化dna分子中的5-甲基胞嘧啶。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其还包括从患者获得包含基因组甲基化dna的生物...
【专利技术属性】
技术研发人员：何川，普拉德尼亚·纳尔赫德，赵伯譞，刘畅，崔晓龙，
申请(专利权)人：芝加哥大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。