冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法技术

冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，本发明专利技术涉及尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。本发明专利技术为了解决现有检测冠心病的方法效率低、费用高以及不能早发现、早治疗的问题。本发明专利技术步骤为：一：尿液样品的采集及预处理；二：尿液样品的制备；三：进行UPLC分离；四：将UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；五：进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；六：对39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到19个代谢通路；七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。本发明专利技术应用于代谢标记物鉴定领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。
技术介绍
冠心病以极高的致死率及致残率成为影响人类健康的主要疾病之一，占所有致命性事件的40％。并且每年全世界范围内因心血管疾病死亡的人数逐年增高。据统计，发达国家心血管病死亡人数将从2000年的500万至2030年将增至6000万。在我国随着经济飞速发展，人民生活水平极大改善，居民生活方式改变，心血管疾病的发病率与死亡率也逐年增高。根据《中国心血管病报告2013》调查结果显示，中国城乡居民心血管病患病率呈上升趋势,死亡率居高不下，全国每年约有350万人死于心血管病。因此，对以冠心病为首的心血管疾病的早期筛查、系统诊治及相关基础研究成为目前我国面临的重大公共卫生问题。多年来人们研究发现冠心病是多种因素作用于不同环节所致的一种复杂疾病。除了早期发现的年龄、性别、血脂异常、肥胖、高血压、糖尿病、不良生活方式等传统危险因素，遗传因素也是导致冠心病发病的主要因素。存在冠心病、糖尿病、高血压、血脂异常家族史的人群冠心病发病率明显增加。近年来已克隆出与冠心病危险因素相关的易感或突变基因200种以上。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有检测冠心病的方法效率低、费用高以及不能早发现、早治疗的问题，而提出的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法按以下步骤实现：步骤一：尿液样品的采集及预处理；步骤二：尿液样品的制备；步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；步骤四：将步骤三中UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；步骤五：根据步骤四进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；步骤六：对步骤五得到的39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到20个代谢通路；步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。专利技术效果：本专利技术建立尿液样品的最适制备方法，优化UPLC-G2-Si-HDMS分析方法学参数。利用已开发UPLC-G2-Si-HDMS代谢组学技术，对400例健康受试者和375例冠心病受试者尿液代谢组进行模式识别分析。结果发现400例健康人和375例冠心病患者经代谢组学模式识别方法得到很好的区分。通过VIP进一步筛选差异代谢物，并进行了定性分析，鉴定了39个冠心病的潜在生物标记物，分别是半乳糖酸，肌酐，二甲基-L-精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2-糠酸，磷酸二乙酯，尿刊酸，L-乙酰，UDP-4脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖，尿酸，柠檬酸，二磷酸鸟苷，7-甲基腺嘌呤，衣康酸，O型磷酸-4-羟基-L-苏氨酸，N1甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺，1-甲基鸟嘌呤，7-氨基甲基-7-卡巴鸟嘌呤，5-磺基水杨酸，多巴胺-4-硫酸，6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸，高香草酸硫酸，乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸，L-谷氨酰胺，间甲酚，多巴醌，吲哚乙酸，壳二糖，壬二酸，对甲苯乙基，L-肉碱辛，21羟基5B-孕3,11,20三酮，11-氧代雄甾酮葡糖苷酸，2-苯基葡糖苷酸，辅酶-1，醇酮葡萄糖醛酸，芥子醇，单乙基己基邻苯二甲酸，这些尿液生物标记物主要与冠心病的19个代谢通路密切相关，主要包括半乳糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸及脯氨酸代谢、组氨酸代谢、氨基糖及核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等。采用ROC曲线分析进一步考察确定与冠心病相关性较高的代谢生物标记物，发现肌酐、尿酸、柠檬酸、7-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、乙酰基-N-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸、L-谷氨酰胺、2-苯基葡萄糖醛酸具有良好的诊断效力。采用本专利技术发现的尿液代谢标记物，仅通过采集尿液就能实现，无创，花费低，诊断快速、便捷，提高了工作效率，有利于冠心病的早发现、早治疗，具有良好的临床诊断潜力和推广价值。附图说明图1为基于UPLCG2-SiHDMS的冠心病受试者尿液样品的正离子模式下PCA得分图(3D)；图2为基于UPLCG2-SiHDMS的冠心病受试者尿液样品的负离子模式下PCA得分图(3D)；图3为冠心病受试者尿液样品的正离子模式下VIP得分图；图4为冠心病受试者尿液样品的负离子模式下VIP得分图；图5为冠心病尿液标记物经MetPA分析的代谢通路图。具体实施方式具体实施方式一：冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法包括以下步骤：步骤一：尿液样品的采集及预处理；步骤二：尿液样品的制备；步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；步骤四：将步骤三中UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；步骤五：根据步骤四进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；步骤六：对步骤五得到的39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到20个代谢通路；步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述步骤一中尿液样品的采集及预处理的具体过程为：每天收集受试者首次空腹晨尿和夜间睡前最后一次尿液，连续收集3天；尿液于12000～13000rpm，4℃离心8～10min，取上清液，置-20℃冰箱中保存备用；样品冻藏前从每个样品中移取1ml分装，其余整体冷冻密封保存。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述步骤二中尿液样品的制备的具体过程为：取室温解冻的尿液在12000～13000rpm，4℃条件下离心8～10min，取上清液，加入蒸馏水稀释，振荡1min，经0.22μm滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述步骤三中UPLC条件为：色谱柱：WatersAcquityTMUPLCHSST3，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为0.1％甲酸乙腈，B为0.1％甲酸水(质量百分含量为0.1％甲酸溶液)；色谱柱温度为40℃；样品仓温度为4℃；流速为0.5ml/min；进样体积为2μl。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述步骤四中进行正负离子扫描分析的质谱条件为：正离子扫描模式：锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为1000L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸-脑啡肽溶液；负离子扫描模式：锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为800L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸-脑啡肽溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述步骤五中39个潜在尿液生物标记物具体为：采用SPSS17.0进行统计分析，共鉴定了39个潜在尿液生物标记物，包括半乳糖酸，肌酐，二甲基-L-精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述鉴定及分析方法包括以下步骤：步骤一：尿液样品的采集及预处理；步骤二：尿液样品的制备；步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；步骤四：将步骤三中UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；步骤五：根据步骤四进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；步骤六：对步骤五得到的39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到20个代谢通路；步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。

【技术特征摘要】
1.冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述鉴定及分析方法包括以下步骤：步骤一：尿液样品的采集及预处理；步骤二：尿液样品的制备；步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；步骤四：将步骤三中UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；步骤五：根据步骤四进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；步骤六：对步骤五得到的39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到20个代谢通路；步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。2.根据权利要求1所述的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述步骤一中尿液样品的采集及预处理的具体过程为：每天收集受试者首次空腹晨尿和夜间睡前最后一次尿液，连续收集3天；尿液于12000～13000rpm，4℃离心8～10min，取上清液，置-20℃冰箱中保存；样品冻藏前从每个样品中移取1ml分装，其余整体冷冻密封保存。3.根据权利要求2所述的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述步骤二中尿液样品的制备的具体过程为：取解冻的尿液在12000～13000rpm，4℃条件下离心8～10min，取上清液，加入蒸馏水稀释，振荡1min，经0.22μm滤膜过滤。4.根据权利要求3所述的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述步骤三中UPLC条件为：色谱柱：WatersAcquityTMUPLCHSST3，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为0.1％甲酸-乙腈，B为0.1％甲酸-水；色谱柱温度为40℃；样品仓温度为4℃；流速为0.40mL/min～0.60mL/min。5.根据权利要求4所述的冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述步骤四中进行正负离子扫描分析的质谱条件为：正离子扫描模式：锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为1000L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸-脑啡肽溶液；负...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱华，王喜军，赵琪琪，刘畅，安娜，
申请(专利权)人：王喜军，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23