基因修饰的免疫细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因修饰的免疫细胞及其应用，该免疫细胞通过CRISPR

【技术实现步骤摘要】
ID NO:21或SEQ ID NO:29所示的任一核苷酸序列。
[0010]较好地，一实施例，所述免疫细胞中，通过慢病毒转染成为嵌合抗原受体的上述免疫细胞，其嵌合抗原受体靶向的靶点为CLDN18.2、GPC3、HER2、TAA、GD2、MSLN、EGFR、NY
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ESO
‑
1、MUC1、PSMA、GUCY2C、Nectin
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4和EBV中的一个或多个。
[0011]较好地，一实施例，所述免疫细胞中，免疫细胞为T细胞、NK细胞、CIK细胞及NKT细胞中的任一种。
[0012]本专利技术还提供一种微生物系，该微生物系含有上述基因修饰的免疫细胞。
[0013]本专利技术还提供一种生物制剂，该生物制剂含有上述基因修饰的免疫细胞或者微生物系。
[0014]本专利技术还提供上述生物制剂以及免疫细胞在制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物方面的应用。
[0015]本专利技术提供的基因修饰的免疫细胞，通过基因编辑技术将目的基因添加到免疫细胞的IFN
‑
γ基因中，具有如下优点：1、在靶细胞的刺激作用下，免疫细胞被靶抗原激活后可诱导表达IL
‑
15；2、免疫细胞在分泌IFN
‑
γ的同时也能分泌IL
‑
15，两者互不影响,进而提升了免疫细胞的持续扩增能力和杀伤肿瘤能力；3、通过CRISPR
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CAS9与gRNA共同构成蛋白的基因编辑技术，可以准确敲除IFN
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γ基因，并且脱靶效应低。
附图说明
[0016]图1为第i条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图2为第ii条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图3为第iii条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图4为第iv条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图5为第v条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图6为第vi条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图7为第vii条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图8为第viii条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图9为第ix条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图10为第x条gRNA对T细胞的IFN
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γ基因敲除效率图；图11为第i条gRNA对目的基因的敲入效率图；图12为第ii条gRNA对目的基因的敲入效率图；图13为第iii条gRNA对目的基因的敲入效率图；图14为第iv条gRNA对目的基因的敲入效率图；图15为第v条gRNA对目的基因的敲入效率图；图16为第vi条gRNA对目的基因的敲入效率图；图17为第vii条gRNA对目的基因的敲入效率图；图18为第viii条gRNA对目的基因的敲入效率图；图19为第ix条gRNA对目的基因的敲入效率图；
图20为第x条gRNA对目的基因的敲入效率图；图21为NT细胞、CLDN18.2
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CAR
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T细胞、GPC3
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CAR
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T细胞、KI
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CLDN18.2
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CAR
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T细胞及KI
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GPC3
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CAR
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T细胞的扩增曲线图；图22为NT细胞的CAR阳性表达流式图；图23为CLDN18.2
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CAR
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T细胞的CAR阳性表达流式图；图24为GPC3
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CAR
‑
T细胞的CAR阳性表达流式图；图25为KI
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CLDN18.2
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CAR
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T细胞的CAR阳性表达流式图；图26为KI
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GPC3
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CAR
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T细胞的CAR阳性表达流式图；图27为NT细胞的GFP阳性表达流式图；图28为CLDN18.2
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CAR
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T细胞的GFP阳性表达流式图；图29为GPC3
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CAR
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T细胞的GFP阳性表达流式图；图30为KI
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CLDN18.2
‑
CAR
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T细胞的GFP阳性表达流式图；图31为KI
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GPC3
‑
CAR
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T细胞的GFP阳性表达流式图；图32为NT细胞、CLDN18.2
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CAR
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T细胞、GPC3
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CAR
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T细胞、KI
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CLDN18.2
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CAR
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T细胞及KI
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GPC3
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CAR
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T细胞的INF
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γ分泌量柱状图；图33为NT细胞、CLDN18.2
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CAR
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T细胞、GPC3
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CAR
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T细胞、KI
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CLDN18.2
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CAR
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T细胞及KI
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GPC3
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CAR
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T细胞的IL
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15分泌量柱状图；图34为NT细胞、CLDN18.2
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CAR
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T细胞、GPC3
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CAR
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T细胞、KI
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CLDN18.2
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CAR
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T细胞及KI
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GPC3
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CAR
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T细胞对肿瘤的特异性杀伤率曲线图。
具体实施方式
[0017]下面结合附图，对本专利技术的较佳实施例作进一步详细说明。
[0018]本专利技术提供多种不同核苷酸序列的gRNA与CRISPR
‑
Cas9分别构成蛋白的基因编辑技术，用于将如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目的基因敲入到免疫细胞的IFN
‑
γ基因中，对免疫细胞的IFN
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γ基因进行基因编辑，使免疫细胞被靶抗原激活后诱导表达IL
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15并提升免疫细胞的持续扩增能力和杀瘤效果，且目的基因可以根据需要，被敲入IFN
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γ基因的任何位置。
[0019]其中，如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列如下：TTTATAATTCCTATATCCTGTGACTGTCTCACTTAATCCTTTGTTTTCTGACTAATTAGGCAAGGCTATGTGATTACA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因修饰的免疫细胞，其特征在于，该免疫细胞的IFN
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γ基因中添加有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目的基因。2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是通过CRISPR
ꢀ‑
Cas9与gRNA共同构成蛋白后添加到IFN
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γ基因中。3.根据权利要求2所述的免疫细胞，其特征在于，所述gRNA分别选自如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示的任一核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的免疫细胞，其特征在于，所述gRNA选自如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丽雅，谢海涛，张凯文，刘东，
申请(专利权)人：深圳市先康达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：