【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种nk细胞培养包被液及nk细胞体外培养方法。
技术介绍
1、自然杀伤细胞(nk)是一种特定类型的淋巴细胞，被认为是先天免疫的一部分，占淋巴细胞总数的10％至15％，是人体免疫系统第一道防线。nk细胞不仅可以清除人体内寄生菌、病毒及老化变异细胞，对癌细胞也具有极强的清除作用。
2、目前在临床上利用nk细胞过继性免疫治疗成为了肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。与t细胞的杀伤作用机制不同，nk细胞的杀伤活性受细胞表面的抑制性受体和激活性受体的共同调控，当激活与抑制的平衡被打破，nk细胞便会行使相应的功能；而nk细胞活化受体包括nkg2d、cd16等，现有技术中有采用抗nkg2d配体mica蛋白和能与cd16结合的cd19抗体，以及cd16抗体用于nk细胞的体外增殖培养的活化激活。然而，现有nk细胞初始体外培养活化能力低。
技术实现思路
1、基于上述问题，本专利技术所要解决的问题在于提供一种可以有效提高活化能力的nk细胞培养包被液及nk细胞体外培养方法。
2、本专利技术提供的nk细胞培养包被液，包含1～10ug/ml抗cd19抗体、10～40ug/mlmica蛋白、1～10ug/ml抗cd16抗体及10～20mlpbs溶液。
3、较好地，所述nk细胞培养包被液中，含2～8ug/ml抗cd19抗体、15～30ug/mlmica蛋白、2～8ug/ml抗cd16抗体及12～17mlpbs溶液。
4、更好地，所述nk细胞培
5、本专利技术还提供使用上述包被液进行体外培养nk细胞的方法，包括步骤如下：
6、第0天：首先，往培养瓶中加入上述nk细胞培养包被液，常温包被于培养瓶内壁4～6h，包被结束后吸出包被液；其次，取单个核细胞1×106～5×106个/ml移至培养瓶中，进行接种处理；再其次，往培养瓶中加入10～40ml激活培养基和5～20v/v％的自体灭活血浆10～40ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、5％co2的培养箱中，进行细胞培养；
7、第3天：往培养瓶中加入20～50ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆10～40ml；
8、第6天：将培养瓶中的所有细胞和培养液转移至培养袋中，往培养袋中加入50～150ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆10～40ml；
9、第9天：往培养袋中加入200～400ml扩增培养基；
10、第12天：往培养袋中加入450～650ml扩增培养基；
11、第15天：往培养袋中加入1000～1500ml扩增培养基；
12、第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养液转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。
13、较好地，上述nk细胞体外培养方法，包括步骤如下：
14、第0天：首先，往培养瓶中加入上述nk细胞培养包被液，常温包被于培养瓶内壁5h，包被结束后吸出包被液；其次，取单个核细胞2×106个/ml移至培养瓶中，进行接种处理；再其次，往培养瓶中加入25ml激活培养基和10v/v％的自体灭活血浆20ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、5％co2的培养箱中，进行细胞培养；
15、第3天：往培养瓶中加入20ml激活培养基和10v/v％的自体灭活血浆20ml；
16、第6天：将培养瓶中的所有细胞和培养液转移至培养袋中，往培养袋中加入50ml激活培养基和10v/v％的自体灭活血浆20ml；
17、第9天：往培养袋中加入200ml扩增培养基；
18、第12天：往培养袋中加入450ml扩增培养基；
19、第15天：往培养袋中加入1000ml扩增培养基；
20、第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养液转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。
21、上述nk细胞体外培养方法中，所述激活培养基包含581培养基，在581培养基中含终浓度10～50ng/ml的il-15、含终浓度10～50ng/ml的il-21、含终浓度10～50ng/ml的il-18及含终浓度500～2000u/ml的il-2。
22、较好地，上述nk细胞体外培养方法中，所述581培养基中含终浓度30ng/ml的il-15、含终浓度20ng/ml的il-21、含终浓度25ng/ml的il-18及含终浓度2000u/ml的il-2。
23、较好地，上述nk细胞体外培养方法中，所述扩增培养基包括581培养基，在581培养基中含终浓度500～2000u/ml的il-2。
24、较好地，上述nk细胞体外培养方法中，所述581培养基中含终浓度1000u/ml的il-2。
25、相对于现有技术，本专利技术具有以下优点：
26、1、nk细胞培养包被液中的抗cd19抗体、mica蛋白、抗cd16抗体组分等，各自都可以充分激活nk细胞，有利于nk细胞的扩增生长，使得nk细胞扩增范围达到1.8×109个/ml～2.2×109个/ml；
27、2、nk培养方法，可以显著提高nk细胞(cd3-cd56+)的纯度(高达97％左右)及肿瘤杀伤活性(如，在效靶比2:1时可达到80％以上)。
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1.一种NK细胞培养包被液，其特征在于，所述包被液包含1～10ug/ml抗CD19抗体、10～40ug/ml MICA蛋白、1～10ug/ml抗CD16抗体及10～20ml PBS溶液。
2.根据权利要求1所述的NK细胞培养包被液，其特征在于，所述包被液包含2～8ug/ml抗CD19抗体、15～30ug/ml MICA蛋白、2～8ug/ml抗CD16抗体及12～17ml PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的NK细胞培养包被液，其特征在于，所述包被液中，包含5ug/ml抗CD19抗体、20ug/ml MICA蛋白、5ug/ml抗CD16抗体及15ml PBS溶液。
4.一种NK细胞体外培养方法，其特征在于，包括步骤如下：
5.根据权利要求4所述的NK细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求4或5所述的NK细胞体外培养方法，其特征在于，所述激活培养基包含581培养基，在581培养基中含终浓度10～50ng/ml的IL-15、含终浓度10～50ng/ml的IL-21、含终浓度10～50ng/ml的IL-
7.根据权利要求6所述的NK细胞体外培养方法，其特征在于，所述581培养基中含终浓度30ng/ml的IL-15、含终浓度20ng/ml的IL-21、含终浓度25ng/ml的IL-18及含终浓度2000U/ml的IL-2。
8.根据权利要求4或5所述的NK细胞体外培养方法，其特征在于，所述扩增培养基包括581培养基，在581培养基中含终浓度500～2000U/ml的IL-2。
9.根据权利要求8所述的NK细胞体外培养方法，其特征在于，所述581培养基中含终浓度1000U/ml的IL-2。
...【技术特征摘要】
1.一种nk细胞培养包被液，其特征在于，所述包被液包含1～10ug/ml抗cd19抗体、10～40ug/ml mica蛋白、1～10ug/ml抗cd16抗体及10～20ml pbs溶液。
2.根据权利要求1所述的nk细胞培养包被液，其特征在于，所述包被液包含2～8ug/ml抗cd19抗体、15～30ug/ml mica蛋白、2～8ug/ml抗cd16抗体及12～17ml pbs溶液。
3.根据权利要求1所述的nk细胞培养包被液，其特征在于，所述包被液中，包含5ug/ml抗cd19抗体、20ug/ml mica蛋白、5ug/ml抗cd16抗体及15ml pbs溶液。
4.一种nk细胞体外培养方法，其特征在于，包括步骤如下：
5.根据权利要求4所述的nk细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求4或5...
【专利技术属性】
技术研发人员：马丽雅，谢海涛，黄璟，
申请(专利权)人：深圳市先康达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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